Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans
Summary
Biofilmes formados nas superfícies dos dentes são altamente complexos e expostos a constante inata e exógenos desafios ambientais, que modulam sua arquitetura, fisiologia e transcriptoma. Nós desenvolvemos uma caixa de ferramentas para examinar a composição, organização estrutural e expressão gênica de biofilmes orais, que pode ser adaptado para outras áreas de pesquisa biofilme.
Abstract
Biofilmes são altamente dinâmicas, comunidades organizadas e estruturadas de células microbianas enredados em uma matriz extracelular de densidade variável e composição 1, 2. Em geral, os biofilmes se desenvolvem a partir de fixação microbiana inicial em uma superfície seguido pela formação de grupos de células (ou microcolônias) e um maior desenvolvimento e estabilização do microcolônias, que ocorrem em uma matriz complexa extracelular. A maioria dos exopolissacarídeos biofilme matrizes porto (EPS), e biofilmes dentários não são excepção, especialmente aqueles associados à doença cárie, que são principalmente mediadas por estreptococos mutans 3. O EPS são sintetizados por microrganismos (S. mutans, um dos principais contribuintes), por meio de enzimas extracelulares, tais como glucosyltransferases usando principalmente sacarose como substrato 3.
Estudos de biofilmes formados nas superfícies dos dentes são particularmente desafiadora devido à sua exposição constante aos desafios ambientais associados a complexos dieta-host-microbial interações que ocorrem na cavidade oral. Melhor compreensão da dinâmica de mudança da organização estrutural e composição da matriz, fisiologia e transcriptoma / profile proteoma de biofilme células em resposta a essas interações complexas seria avançar o conhecimento atual de como biofilmes orais modular a patogenicidade. Por isso, temos desenvolvido uma caixa de ferramentas analíticas para facilitar a análise do biofilme em níveis estruturais, bioquímicos e moleculares, combinando técnicas comumente disponíveis e romance com custom-made software para análise de dados. Padrão de análise (ensaios colorimétricos, RT-qPCR e microarrays) e novas técnicas de fluorescência (para a rotulagem simultânea de bactérias e EPS) foram integrados com software específico para análise de dados para resolver a complexa natureza da pesquisa biofilme oral.
A caixa de ferramentas é composto por 4 etapas distintas, mas interligadas (Figura 1): 1) Os bioensaios, 2) entrada de dados brutos, 3) Processamento de Dados, e 4) Análise de Dados. Nós usamos o nosso modelo in vitro de biofilme e específicas condições experimentais para demonstrar a utilidade ea flexibilidade da ferramenta-box. O modelo de biofilme é simples, reprodutíveis e várias réplicas de um único experimento pode ser feito simultaneamente 4, 5. Além disso, permite a avaliação temporal, inclusão de diversas espécies microbianas 5 e avaliação dos efeitos de diferentes condições experimentais (por exemplo, tratamentos 6; comparação de mutantes knockout vs cepa parental 5; carboidratos disponibilidade 7). Aqui, descrevemos dois componentes específicos da caixa de ferramentas, incluindo (i) novo software para microarray de mineração de dados / organização (MDV) e análise de imagens de fluorescência (DUOSTAT), e (ii) in situ EPS rotulagem. Nós também fornecemos um caso experimental mostrando como a caixa de ferramentas pode ajudar com biofilmes análise, os dados da organização, integração e interpretação.
Protocol
Discussion
Nesta apresentação, demonstramos dois componentes críticos do Analytical caixa de ferramentas (EPS / bactérias imagem e microarray de mineração de dados / processamento), a versatilidade e utilidade das várias análises integradas no sistema. Claramente, a caixa de ferramentas facilitou a análise abrangente (comparativo) e simultânea dos vários aspectos da bioquímica biofilmes, arquitetura e expressão gênica em resposta às diferentes condições experimentais, utilizando um modelo in vitro.</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Gary Xie e Herbert Lee para o desenvolvimento do MDV. Agradecemos também os drs. Simone Duarte, Ramiro Murata, Jae-Gyu Jeon, Jacqueline Abranches, e Ms. Stacy Gregoire por sua contribuição técnica e científica para os componentes analíticos da caixa de ferramentas. Este estudo foi apoiado em parte pela USPHS Research conceder DE018023 do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | ||
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | ||
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | ||
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus, Tokyo, Japan |
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