Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile
Summary
Diş yüzeylerinde oluşan Biyofilmler, son derece karmaşık ve kendi mimari modüle doğuştan sabit ve dışsal çevre sorunlarına, fizyoloji ve transcriptome maruz. Bileşimi, yapısal organizasyon ve oral biyofilmlerin biyofilm araştırmanın diğer alanlara adapte olabilen gen ekspresyonu, incelemek için bir araç kutusu geliştirdi.
Abstract
Biyofilmler, son derece dinamik, değişken yoğunluklu ve kompozisyon 1, 2, ekstraselüler matriks ağına düşmüştür mikrobiyal hücrelerin düzenli ve yapılandırılmış topluluklar . Genel olarak, biyofilm hücre kümeleri (veya mikrokoloniler) ve karmaşık bir matriks meydana gelen mikrokoloniler daha da geliştirilmesi ve istikrar oluşumu takip eden bir yüzey üzerine ilk mikrobiyal eklenti gelişir. Biyofilm matrisler liman exopolysaccharides (EPS), ve diş biyofilm çoğunluğu bir istisna vardır; özellikle çürük hastalığı, çoğunlukla mutans streptokok 3 aracılı ile ilgili olanlar. EPS öncelikle 3 substrat olarak sakaroz kullanılarak glucosyltransferases gibi ekstrasellüler enzimler, mikroorganizmalar tarafından sentezlenen (S. mutans, önemli katkıda).
Diş yüzeylerinde oluşan biyofilm çalışmaları özellikle oral kavite meydana gelen karmaşık diyet-host-mikrobiyal etkileşimi ile ilgili çevre sorunlarına karşı sürekli maruz kalma nedeniyle karşı karşıya olduğu zorluklardır. Bu karmaşık etkileşimler yanıt yapısal organizasyon ve matriks kompozisyonu, fizyoloji ve transcriptome / biyofilm hücrelerinin proteom profili dinamik değişiklikleri daha iyi anlaşılması sözlü biyofilm patojenite modüle nasıl mevcut bilgi daha önceden. Bu nedenle, biz, ısmarlama yazılım ile veri analizi için yaygın olarak bulunan ve yeni teknikleri bir araya getirerek, yapısal, biyokimyasal ve moleküler düzeyde biyofilm analizi kolaylaştırmak için alet kutusu analitik bir geliştirdik. Standart analitik (kolorimetrik testleri, RT-qPCR ve mikroarray'ler) ve yeni floresans teknikleri (bakteri ve EPS eşzamanlı etiketleme için) oral biyofilm araştırma karmaşık doğası adres veri analizi için özel bir yazılım ile entegre edildi.
Alet kutusu, 4 farklı ama birbirine bağlı adımları (Şekil 1) oluşur: 1) biyoanalizlere, 2) Ham Veri Girişi, 3) Bilgi İşlem, ve 4) Veri Analizi. Biz alet kutusu kullanışlılığı ve esneklik göstermek için, in vitro biyofilm modeli ve özel deneysel koşullar kullandı . Biyofilm modeli, basit, tekrarlanabilir ve birden fazla tek bir deney çoğaltır, aynı anda 4 5 yapılabilir . Ayrıca, temporal değerlendirme, çeşitli mikrop türlerinin dahil 5 farklı deney koşullarının etkilerinin değerlendirilmesi (örneğin tedaviler 6; nakavt mutantlar karşılaştırılması vs ebeveyn zorlanma 5; karbonhidrat kullanılabilirlik 7) izin verir . Burada, alet kutusu mikroarray veri madenciliği / kuruluş (MDV) ve floresan görüntüleme analizi (DUOSTAT) için yeni yazılım (i) dahil olmak üzere iki belirli bileşenleri, tarif etmek, ve (ii) EPS-etiketleme yerinde. Ayrıca alet kutusu biyofilm analizi, veri organizasyonu, entegrasyon ve yorumlama ile nasıl yardımcı olabilir gösteren deneysel bir durum sağlar.
Protocol
Discussion
Bu sunumda, iki kritik bileşenleri Analitik Aracı-Box (EPS / bakteri görüntüleme ve mikroarray veri madenciliği / işleme), sisteme entegre çeşitli testlerin çok yönlülük ve yararlılığını göstermiştir. Açıktır ki, alet kutusu, bir in vitro model kullanarak farklı deneysel koşullar yanıt biyofilm biyokimya, mimari ve gen ekspresyonu çeşitli yönlerini kapsamlı (karşılaştırmalı) ve eş zamanlı analiz kolaylaştırdı. 7 dinamik ve karmaşık değişiklikler göz önün…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar MDV gelişimi için Dr. Gary Xie ve Herbert Lee teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr teşekkür. Simone Duarte, Ramiro Murata, Jae-Gyu Jeon, Jacqueline Abranches ve analitik araç kutusu bileşenleri için teknik ve bilimsel katkılarından dolayı Bayan Stacy Gregoire. Bu çalışmada, Diş ve Kraniofasial Araştırma National Institute of USPHS Araştırma hibe DE018023 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | ||
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | ||
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | ||
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus, Tokyo, Japan |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Leme, P. a. e. s., Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. u. r. y. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation–new insight. J Dent Res. 85, 878-887 (2006).
- Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries. J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).
- Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).
- Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms. BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).
- Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development. PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).
- Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms. Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).
- Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol. J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).
- Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).
- Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development. Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).
- Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).
- Xiao, J., Koo, H. Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms. J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).
- Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).
- Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r., Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >., Crielaard, W. Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms. J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).
