Zusammensetzung der polaren Lipid-Extrakte und der Fettsäure-Zusammensetzung der einzelnen Glycerolipide sind in einem einfachen und robusten Lipid-Profiling Experiment bestimmt. Zu diesem Zweck sind Glycerolipide durch Dünnschicht-Chromatographie isoliert und Transmethylierung ihrer Acylgruppen. Fatty Acyl Methylester durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie quantifiziert.
Biologische Membranen einzelner Zellen aus der Umwelt. Aus einer einzigen Zelle zu vielzelligen Pflanzen und Tieren, Glycerolipide, wie Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin, Form-Doppelschicht-Membranen, die sowohl als Grenzen und Schnittstellen für die chemische Austausch zwischen Zellen und ihrer Umgebung zu handeln. Im Gegensatz zu Tieren haben Pflanzenzellen eine spezielle Organellen für die Photosynthese, die Chloroplasten. Die komplizierte Membransystem der Chloroplasten enthält einzigartige Glycerolipide, nämlich Glykolipide fehlt Phosphor: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), Digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Die Rolle dieser Lipide sind über die reine strukturelle. Diese Glykolipide und andere Glycerolipide wurden in den Kristallstrukturen von Photosystem I und II mit den Engagements von Glycerolipiden bei der Photosynthese 8,11 gefunden. Während Phosphat Hunger, ist DGDG zu extraplastidic Membranen übertragen, um den Verlust von Phospholipiden 9,12 kompensieren.
Viel von unserem Wissen über die Biosynthese und Funktion dieser Lipide wurde aus einer Kombination von genetischen und biochemischen Studien mit Arabidopsis thaliana 14 geschlossen wurde abgeleitet. Während dieser Studien wurde ein einfaches Verfahren für die Analyse von polaren Lipiden wurden für das Screening und Analyse von Lipid-Mutanten wesentlich und werden im Detail erläutert werden. Ein Blatt Lipidextrakt wird zunächst durch Dünnschichtchromatographie (TLC) getrennt und Glycerolipide sind reversibel mit Joddampf gefärbt. Die einzelnen Lipide werden aus der DC-Platte abgekratzt und konvertierte zum Fettacyl Methylester (FAME), die durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie mit Flammenionisationsdetektor (FID-GLC) (Abbildung 1) gekoppelt analysiert werden. Diese Methode hat sich bewährt, um eine zuverlässige Werkzeug für Mutanten-Screening werden. Zum Beispiel die tgd1, 2,3,4 endoplasmatischen Retikulum-to-Plastiden Lipid Handels-Mutanten wurden auf Basis der Akkumulation von einer anormalen galactoglycerolipid entdeckt: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) und eine Abnahme in der relativen Menge von 18:3 (Kohlen: Doppel- Anleihen) Fettacylgruppen in Membranlipiden 3,13,18,20. Diese Methode ist auch anwendbar für die Bestimmung enzymatischer Aktivitäten von Proteinen unter Verwendung von Lipiden als Substrat 6.
TLC gekoppelt mit GLC bietet eine robuste und schnelle Werkzeug für die quantitative Analyse von polaren Lipiden in Pflanzen. Kleine Veränderungen in Lipid-Zusammensetzung identifiziert werden können, daher hat diese Methode für große Screening von Mutanten in polaren Lipid-Stoffwechsel 1,20 beeinträchtigt worden. Diese Methode wird auch häufig für die Überwachung der Aktivitäten der Enzyme nutzen polaren Lipiden als Substrat verwendet. 2,6,7
Neben verlässt, kann die Lipid-Zusammensetzung von anderen pflanzlichen Geweben wie Wurzeln und Samen oder subzellulären Fraktionen wie Chloroplasten und Mitochondrien auch in der gleichen Weise bestimmt werden.
Das Lösungsmittel-System (Aceton, Toluol, Wasser) ist hier für die Trennung von Glycolipiden und Phospholipiden in Pflanzen optimiert. Doch in tgd1, 2,3,4-Mutanten und isolierten Chloroplasten läuft TGDG zusammen mit PE während tetragalactosyldiacylglycerol läuft mit PC. In diesem Fall wird ein Lösungsmittel mit Chloroform, Methanol, Essigsäure und Wasser (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) wird 13 verwendet. Manchmal zweidimensionale TLC mit zwei verschiedenen Lösungsmittel-Systeme ist es, weitere separate Glycolipide und Phospholipide 19 durchgeführt. Darüber hinaus können pflanzliche Gewebe direkt auf die FAME Reaktion durch GLC gefolgt, um den gesamten Fettsäuregehalt Profil ohne anfängliche Trennung auf TLC 5 zu bestimmen unterzogen werden. Neben dem Beweis TLC-GLC System, ist eine weitere Methode für die Lipid-Profile genutzt, auf direktem Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie 17 beruht. Bei dieser Methode wird die erste chromatographische Trennung von Lipiden in der Extrakt wird weggelassen. Allerdings erfordert diese Methode teure Ausrüstung und erfahrenes Personal, das es weniger nützlich für Routine-Analysen im Labor oder für Mutanten-Screening macht.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss von US-amerikanischen National Science Foundation an Christoph Benning unterstützt.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
α-naphthol | Sigma-Aldrich | N1000 | ||
Methanolic HCL 3N | Sigma-Aldrich | 33050-U | Dilute to 1N by methanol | |
Si250-PA TLC plates | J.T.Baker | 7003-04 | With pre-absorbent | |
TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z266000 | ||
Screw cap tubes | VWR | 53283-800 | ||
Scew caps | Sun Sri | 13-425 | ||
PTFE disk | Sun Sri | 200 608 | ||
GLC system | Hewlett Packard | HP6890 | ||
DB-23 column | J&W Scientific | 122-2332 | ||
GLC vials | Sun Sri | 500 132 | ||
Caps of GLC vials | Sun Sri | 201 828 | ||
Chemstation software | Agilent | G2070AA |