1. La extracción de lípidos Comenzar la extracción de lípidos de la cosecha de 30 mg de 4 semanas de edad, hojas de Arabidopsis a partir de plantas cultivadas en agar solidificado medio o en el suelo y transferirlas a tubos de 1,5 ml de la reacción de polipropileno. Las hojas frescas se puede flash congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Añadir 300 l de extracción de solventes compuesto por metanol, cloroformo y ácido fórmico (20:10:01, v / v / v) para cada muestra. Agitar vigorosamente (con un agitador de pintura o similar) durante 5 minutos. Añadir 150 ml de ácido fosfórico 0,2 M (H 3 PO 4), 1 M de cloruro de potasio (KCL) y agitar brevemente. Se centrifuga a 13.000 xg a temperatura ambiente durante 1 minuto. Lípidos disueltos en la fase inferior de cloroformo se colocan sobre placas TLC. 2. Cromatografía en capa fina (TLC) 15 Para preparar las placas de TLC, se sumergen una placa de gel de sílice recubiertas 20cmx20cm TLC con la carga de la tira durante 30 segundos en 0,15 M de sulfato de amonio ((NH 4) 2 SO 4) solución, después de sumergir durante 30 segundos, secar la placa por lo menos 2 días un recipiente tapado. Durante la activación de la sublimación de amonio deja tras de ácido sulfúrico, que protona fosfatidilglicerol necesarios para su separación de glicerolípidos otros. En el día de experimento, activar TLC placas de hornear en un horno a 120 ° C durante 2,5 horas. Después del enfriamiento de las placas activa a temperatura ambiente, utilice un lápiz para dibujar una línea recta (1,5 cm del borde de la placa) a través de la placa en el origen del cromatograma. En una campana extractora, lentamente entregar 3 x 20 l de extracto de lípidos en la fase inferior de cloroformo con una pipeta 20 ml con 200 l puntas amarillas de plástico bajo una corriente lenta de N 2. Para ello, un tubo de Tygon se conecta al regulador de la N 2 tanque. Mantenga el lugar de menos de 1 cm de diámetro. Cada placa tiene capacidad para 10 muestras (al posterior análisis de GLC está previsto). Como los lípidos manchas completamente seca en la campana de humos, preparar el disolvente de desarrollo compuesto de acetona, tolueno, agua (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Si la humedad ambiental relativa del aire es alta, la separación podría ser afectada. En este caso el agua debe ser reducida para dar (91 ml: 30 ml: 7,0 ml) para conseguir la separación deseada. Verter 80 ml de disolvente en el desarrollo de un TLC sellar el desarrollo de la cámara (L: H: W = 27,0: 26,5: 7.0, cm / cm / cm) y se coloca la placa en el tanque con el fin de la muestra hacia abajo. Sellar el tanque con la abrazadera. El disolvente ascenderá la placa y los lípidos se separarse. El tiempo de desarrollo es de aproximadamente 50 minutos a temperatura ambiente. Cuando el frente del disolvente se sitúe a 1 cm de la parte superior de la placa, retire con cuidado la placa de la cubeta y se seque por completo en la campana de humos durante 10 minutos aproximadamente. Lípidos separados por TLC puede ser reversible manchado brevemente con yodo para el análisis cuantitativo o irreversiblemente teñidas con ácido sulfúrico o α-naftol. Sulfúrico carbonización ácido: Pulverizar la placa con el 50% de ácido sulfúrico en agua en una botella rociadora de vidrio en la campana extractora de humos y hornee a 120 ° C durante 15 minutos (Figura 2). α-naftol la tinción de glicolípidos: Pulverizar la placa con el 2,4% (w / v) α-naftol en el 10% (v / v) de ácido sulfúrico, 80% (v / v) de etanol y hornee a 120 ° C durante 3-5 minutos hasta que las bandas glicolípido se tiñen de color rosa o púrpura (Figura 2B). El tratamiento excesivo dará lugar a la carbonización de todos los lípidos debido a la presencia de ácido sulfúrico en el reactivo. Tinción de yodo: en una campana de extracción, se coloca la placa en un tanque cerrado TLC con cristales de yodo (en una bandeja en la parte inferior que conduce a la saturación de la atmósfera con vapor de yodo hasta que los lípidos son visibles). No exponga la placa de yodo mucho tiempo como el yodo covalente puede modificar los ácidos grasos poliinsaturados (Figura 2C). Por otra parte, para evitar la oxidación de los lípidos, sólo los carriles estándar intercalados con los carriles de la muestra debe ser manchada con una lana de vidrio conectado pipeta Pasteur con cristales de yodo a través del cual N 2 es soplado sobre carriles individuales estándar. 3. Acil éster metílico (FAME) Reacción 16 Eliminar la sílice rodean identificado puntos de lípidos de la placa de TLC con una cuchilla de afeitar. Raspe la sílice que contienen lípidos y transferir el polvo de sílice usando un embudo en un tubo de vidrio con tapón de rosca de teflón (PTFE) a ambos lados. Añadir 1 ml 1 N de ácido clorhídrico (HCl) en metanol anhidro a cada muestra por pipeta. Añadir 100 ml de 50 mg mL -1 pentadecanoico ácido (15:00) con una pipeta 200 l de cada muestra como patrón interno con una pipeta 200 l con 200 l punta de plástico amarillo. Mantenga un tubo con sólo ácido pentadecenoic metanólica de HCl como un control. Cerrar los tubos de vidrio herméticamente con tapas recubierto de teflón. Incubar gltubos de culo en un baño de agua de 80 ° C durante 25 minutos. Los tubos deben ser sellados para que el disolvente no se evapora. Después de los tubos se hayan enfriado, añada 1 ml de cloruro de sodio al 0,9% seguido de un ml de hexano y agitar vigorosamente. Centrifugar las muestras a 1000xg durante 3 minutos. En la campana extractora de humos, retire la capa de hexano / superior de la muestra con pipeta Pasteur y colocarla en un tubo de vidrio nuevo 13×100 mm. Evaporar hexano bajo una corriente lenta de N 2 sin secar por completo. Disolver el resultado acil methylesters s en 60 l de hexano. Transferencia de las muestras en viales muestreador automático y tapa. Las muestras pueden ser almacenadas a 4 ° C para el corto plazo y -20 º C durante unos días. 4. Cromatografía de gas líquido (GLC) 10 Antes de comenzar GLC, asegúrese de que el hidrógeno helio, y los cilindros de aire se llenan. Hexano suficiente hay que añadir a la reserva de disolvente y el contenedor de residuos debe estar vacío. Para la separación de grasas methylesters acilo, adjuntar una DB-23 columna de la máquina. Viales lugar en el inyector automático. Inicie el software ChemStation en la CGL en el sistema informático. Ajuste la temperatura de entrada a 250 ° C con una tasa de flujo de helio a 48.6 mL min-1 y la presión a 21,93 psi. La relación de separación es de 30,0: 1. La temperatura del horno se establece inicialmente a 140 ° C durante 2 minutos y elevó a 160 ° C a una velocidad de 25 ° C min -1. A continuación, ajuste la temperatura aumentará de 160 ° C a 250 ° C a una velocidad de 8 ° C min -1 y mantener a 250 º C durante 4 minutos seguido de una disminución a 140 ° C a una velocidad de 38 ° C min – 1. Una carrera dura aproximadamente 21 minutos. La temperatura del detector de ionización de llama es de 270 ° C con un caudal de hidrógeno de 30.0 mL min-1, la tasa de flujo de aire a 400 mL min-1 y la tasa de flujo de helio a 30.0 mL min-1. Introduce el número de viales y nombre de la muestra en la tabla de secuencia de ejecución. Ajuste el inyector de 10 l para inyectar 2 l de la muestra por vial. Cuando el instrumento está listo, inicie la secuencia de ejecución. 5. Los resultados representativos: Ejemplos de tinción irreversible del TLC separados por los lípidos de plantas Arabidopsis de 4 semanas de edad se muestra en la Figura 2. Los lípidos de ácido sulfúrico manchada (Figura 2A) están carbonizados y aparecen como manchas de color marrón. α-naftol se prefiere a la mancha glicolípidos como MGDG, DGDG, SQDG glicolípidos etc teñidas con α-naftol llevar un color rosa-púrpura, mientras que otros lípidos polares mancha amarilla (Figura 2B). La tinción de yodo es reversible y lípidos da un color amarillento que va a desaparecer en un corto tiempo se evapora el yodo (Figura 2C). Lípidos brevemente manchados de yodo puede ser objeto de análisis por GLC a pesar de lípidos sin manchas son preferibles a reducir la descomposición de los lípidos. Si se hace correctamente, las señales distintivas que representan a diferentes grasos éster metílico de acilo se podrá realizar GLC (Figura 3). Éster metílico de acilo graso con cadena de carbono más cortas y menos enlaces dobles tienen menor tiempo de retención con el DB-23 de la columna. Acil perfiles de éster metílico es una herramienta sensible para identificar mutantes con la composición de lípidos alterados. En la Figura 4, el MGDG18: 3 proporción de ácidos grasos molar se encuentra disminuida en el mutante tgd4-1 en comparación con el tipo salvaje de 18 años. Dividiendo los moles de éster metílico de acil grasos de los lípidos de clase uno con los moles de todas las clases de lípidos, la relación molar de cada uno de los lípidos se calculan. Por ejemplo, para calcular la proporción molar de MGDG: (MGDG)% mol = Σ [FAME (MGDG)] / Σ [FAME (total)] x 100% Las proporciones resultantes molar de cada clase de lípidos, tanto la de tipo salvaje y el mutante se puede comparar. Por ejemplo, el mutante tgd4-1 ha aumentado las cantidades relativas de MGDG y PG, pero disminuyeron las cantidades de DGDG y PE (Figura 5) 18. Figura 1. Diagrama de flujo del análisis de los lípidos polares con plántulas de Arabidopsis. Lípidos totales se extraen de plantas Arabidopsis de 4 semanas de edad, y separados por TLC. Los lípidos separados puede ser raspado de la placa de TLC para la transesterificación seguida de análisis por GLC. Figura 2. Separación de los lípidos en las placas de TLC. Extractos de lípidos de 35 mg (peso fresco) plántulas de tipo silvestre están separados por TLC y teñidas por el ácido sulfúrico (A), α-naftol (B) o el vapor de yodo (C). Tres repeticiones se muestran en cada método de tinción. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, la fosfatidilcolina, PE, fosfatidiletanolamina, PG, phosphatidylglycerol, PI, fosfatidilinositol, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. Figura 3. Análisis por GLC de Methylesters ácidos grasos (FAME) derivado de MGDG del tipo salvaje. FAME se separan en una columna de 30 m capilar y detectados por ionización de llama. Pentadecanoico ácido (15:00) se utiliza como estándar interno. Figura 4. Perfil de ácidos grasos de MGDG en el tipo salvaje Col2 (columnas blancas) y el tgd4-1 mutante (columnas de negro). Los ácidos grasos se presentan como el número de carbonos seguido por el número de dobles enlaces. Tres repeticiones se hacen un promedio y las desviaciones estándar se muestran. Figura 5. Composición de los lípidos polares del tipo salvaje Col2 (columnas blancas) y el tgd4-1 mutante (columnas de negro). Tres repeticiones se hacen un promedio y las desviaciones estándar se muestran con barras de error.