バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集
Summary
ITCは、そのホストへのリガンドの結合を研究するための強力なツールです。複雑なシステムではしかし、いくつかのモデルも同様にデータをフィットすることがあります。ここで説明する方法は、複雑なシステムのための適切な結合モデルを解明し、対応する熱力学的パラメータを抽出する手段を提供します。
Abstract
等温滴定熱量測定（ITC）は、一般的に、ホスト高分子のリガンドの結合に関連する熱力学的パラメータを決定するために使用されます。 ITCは、ホスト/リガンド相互作用を研究するための一般的な分光学的方法に比べていくつかの利点があります。たとえば、2つのコンポーネントが相互作用するときに放出または吸収された熱が直接測定され、任意の外生的な記者を必要としません。したがって、結合エンタルピーと会合定数（KA）は直接ITCデータから得られる、とエントロピーの寄与を計算するために使用することができます。また、等温線の形状は、c -値と関係する機械的なモデルに依存しています。 C -値は、[P] Tはタンパク質濃度であり、そしてnは、ホスト内のリガンド結合部位の数であり、C = N [P] TKA、として定義されています。多くの場合、特定のリガンドのための複数の結合部位は非等価であり、ITCは、個々の結合部位の熱力学バインディングパラメータの特性評価が可能になります。しかし、これは正しいバインディングモデルを使用する必要があります。異なるモデルで同じ実験データをフィットできる場合は、この選択は、問題となる可能性があります。我々は以前この問題は、c -値のいくつかで実験を行うことにより回避できることが示されている。 C -値は異なるで得られた複数の等温線は、別のモデルを同時にフィットされています。正しいモデルは、次の変数全体の- cデータセット全体の適合度に基づいて識別されます。このプロセスは、アミノグリコシド耐性の原因となる酵素アミノグリコシドN – 6' -アセチルトランスフェラーゼ- II（AAC（6'）- II）にここに適用されます。私たちの方法論は、あらゆるシステムに適用可能であるが、この戦略の必要性が良くアロステリック効果や協同性を示す高分子 – リガンドシステムで実証、および別の結合モデルは、同じデータに本質的に同一のフィットを提供する場合です。私たちの知識に、市販のそのようなシステムはありません。 AAC（6'）- II、二つのサブユニット間の協同性を示す、二つの活性部位を含むホモ二量体である。しかしC -値の単一で得られたITCのデータは、少なくとも2つの異なるモデルが二組 – の部位に依存しないモデルと二サイトシーケンシャル（協同組合）のモデルにも同様にフィットすることができます。上記で説明したように、C -値を変化させることを通じて、それは、AACの正しい結合モデル（6'）- IIは、2つのサイトシーケンシャル結合モデルであることが設立されました。ここで、我々は、ITCの実験を行う際に、変数- cの分析に適したデータセットを得るためにに必要な手順を説明します。
Protocol
Discussion
変数に- cフィッティングのこの分析部分は、以前は詳細10で説明されています。ここでは、このアプローチに適した変数に- cデータセットを収集するの実用的側面を報告する。それはすべての蛋白質とリガンドのサンプルが同じストック溶液から引き出されていることが不可欠です。したがって、十分なストック溶液は実験のシリーズ全体を完了するために最初に用意されていること…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、カナダのヘルスリサーチの研究所（CIHR）、国立科学と工学研究評議会（NSERC）、およびCIHR訓練助成金（LFへ）によってサポートされていました。私たちは、AACのための教授ジェラルドD.ライト（マクマスター大学、カナダ）（6）- IIの発現は、プラスミド感謝。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetyl coenzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | ||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher | 7365-45-9 | ||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | ||
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | ||
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR | 281445-477 | ||
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman | 7184-004 | ||
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements | |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
- Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
- Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
- Okhrimenko, O. k. s. a. n. a., J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
- Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -. N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
- Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
- Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
- Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -. a., Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
- Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6′)-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).
- Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
- MicroCal. . ITC Data Analysis in Origin. , (2004).
