Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison
Summary
ITC est un outil puissant pour étudier la liaison d'un ligand à son hôte. Dans les systèmes complexes cependant, plusieurs modèles peuvent ajuster les données aussi bien. La méthode décrite ici fournit un moyen d'élucider le modèle approprié contraignante pour les systèmes complexes et d'extraire les paramètres thermodynamiques correspondants.
Abstract
Calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est couramment utilisé pour déterminer les paramètres thermodynamiques associés à la liaison d'un ligand à une macromolécule hôte. ITC a certains avantages sur des approches communes pour étudier par spectroscopie d'hôte / ligand interactions. Par exemple, la chaleur dégagée ou absorbée lorsque les deux composants interagissent est directement mesurée et ne nécessite aucune journalistes exogènes. Ainsi, l'enthalpie de liaison et la constante d'association (Ka) sont obtenues directement à partir de données CCI, et peut être utilisé pour calculer la contribution entropique. Par ailleurs, la forme de l'isotherme est dépendante de la Valeur-C et le modèle mécaniste impliqués. La Valeur-C est défini comme c = n [P] TKA, où [P] l est la concentration en protéines, et n est le nombre de sites de liaison au ligand au sein de l'hôte. Dans de nombreux cas, plusieurs sites de liaison pour un ligand donné ne sont pas équivalents et l'ITC permet la caractérisation des paramètres thermodynamiques de liaison pour chaque site individuel contraignant. Cela exige cependant que le modèle correct contraignante être utilisé. Ce choix peut être problématique si les différents modèles peuvent tenir les mêmes données expérimentales. Nous avons précédemment montré que ce problème peut être contourné en réalisant des expériences dans plusieurs C-valeurs. Les isothermes de multiples obtenues à différentes valeurs de c-sont aptes simultanément à des modèles séparés. Le modèle correct est ensuite identifié sur la base des qualité de l'ajustement sur l'ensemble de variables-c données. Ce processus est appliqué ici à l'aminoglycoside résistance provoquant aminoglycoside enzyme N-acétyl-6'-II (AAC (6 ')-II). Bien que notre méthodologie est applicable à tout système, la nécessité de cette stratégie est mieux démontrée avec un système ligand-macromolécule montrant allostérie ou coopérativité, et quand différents modèles de fixation s'adapte fournissent essentiellement identiques aux mêmes données. À notre connaissance, il n'existe pas de tels systèmes disponibles dans le commerce. AAC (6 ')-II, est un homo-dimère contenant deux sites actifs, en montrant la coopérativité entre les deux sous-unités. Toutefois, les données obtenues à l'ITC d'un seul c-valeur peut être adapté aussi bien à au moins deux modèles différents d'un modèle à deux ensembles de sites indépendants et une à deux sites séquentielle (coopérative) modèle. Grâce à varier le C-valeur comme expliqué ci-dessus, il a été établi que le modèle correct contraignante pour AAC (6 ')-II est un site de deux modèle séquentiel contraignant. Nous décrivons ici les étapes qui doivent être prises lors de la réalisation d'expériences CCI en vue d'obtenir des ensembles de données adapté à la variable c-analyses.
Protocol
Discussion
Cette partie analytique de variable c montage a été précédemment décrit en détail 10. Nous rapportons ici les aspects pratiques de la collecte variable c ensembles de données adapté à cette approche. Il est essentiel que toutes les protéines et les échantillons de ligand sont tirées des solutions même stock. Il est donc important que la solution stock suffisant est préparé initialement pour compléter la série entière d'expériences. Cela garantit le ratio de l'AAC (6 ')-II et AcC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC), en sciences naturelles et en génie (CRSNG), et une bourse d'études de formation des IRSC (pour LF). Nous remercions le professeur Gérard D. Wright (Université McMaster, Canada) pour l'AAC (6)-Ii plasmide d'expression.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetyl coenzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | ||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher | 7365-45-9 | ||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | ||
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | ||
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR | 281445-477 | ||
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman | 7184-004 | ||
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements | |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
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