جمع متغير تركيز الكالوري المعايرة متحاور مجموعات البيانات من أجل تحديد آليات ملزمة
Summary
مركز التجارة الدولية هو أداة قوية لدراسة الربط من يجند لمضيفه. في الأنظمة المعقدة ومع ذلك ، قد عدة نماذج تتناسب مع البيانات بشكل جيد على قدم المساواة. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة لتوضيح النموذج المناسب ملزمة للنظم المعقدة واستخراج المعلمات الحرارية المقابلة.
Abstract
ويشيع استخدام قياس الكالوري المعايرة متحاور (ITC) لتحديد معالم الحرارية المرتبطة ملزمة ليجند لجزيء المضيف. مركز التجارة الدولية لديها بعض المزايا على نهج مشترك لدراسة الطيفية المضيف / يجند التفاعلات. على سبيل المثال ، يتم قياس الحرارة بشكل مباشر أو امتصاصها سراح عنصرين عندما تتفاعل و لا يتطلب أي صحفيين الخارجية. وبالتالي يتم الحصول عليها بشكل مباشر على السخانة ملزمة وثابتة الجمعيات (كا) من بيانات مركز التجارة الدولية ، ويمكن استخدامها لحساب مساهمة التدهور الحتمي. علاوة على ذلك ، شكل الأيسوثرم يعتمد على القيمة ج الآلي ونموذج المشاركة. يتم تعريف القيمة ك ج ج = ن [ف] TKA ، حيث [ف] t هي تركيز البروتين ، و n هو عدد من المواقع داخل ملزم يجند المضيف. في كثير من الحالات ، ومواقع متعددة لملزم يجند المعطاة هي غير متكافئة ومركز التجارة الدولية تسمح للتوصيف المعلمات ملزم الحرارية لموقع ملزمة لكل فرد. لكن هذا يتطلب أن يتم استخدام النموذج الصحيح ملزمة. هذا الخيار يمكن أن يكون مشكلة إذا كان يمكن احتواء نماذج مختلفة على نفس البيانات التجريبية. لقد أظهرنا سابقا أن هذه المشكلة يمكن التحايل عليها إجراء التجارب في العديد من القيم ، ج. وتناسب الأيسوثرم متعددة حصلت في مختلف ج قيم في نفس الوقت إلى نماذج منفصلة. يتم تعريف النموذج الصحيح المقبلة على أساس من التوافق الخير عبر ورقة العمل متغيرة ج بأكمله. يتم تطبيق هذه العملية هنا إلى أمينوغليكوزيد المقاومة المسببة للأمينوغليكوزيد انزيم – N – 6' أسيتيل – II (AAC (6 ') – II). على الرغم من أن لدينا منهجية تنطبق على أي نظام ، ويتجلى على نحو أفضل ضرورة هذه الاستراتيجية مع نظام جزيء ، أو يجند تظهر allostery cooperativity ، وعندما تقدم نماذج مختلفة تناسب ملزمة أساسا مطابقة لنفس البيانات. على حد علمنا ، لا توجد مثل هذه النظم المتاحة تجاريا. الجميح للسيارات (6 ') ، الجزء الثاني ، هو هومو ديمر تحتوي على موقعين النشطة ، والتي تبين cooperativity بين مفارز اثنين. ومع ذلك ، يمكن الحصول على بيانات مركز التجارة الدولية في واحدة من طراز C – قيمة يكون لائقا أيضا بالتساوي على اثنين على الاقل من نماذج مختلفة نموذجا اثنين من مجموعات من مواقع مستقلة وثنائية موقع متسلسل النموذج (التعاونية). ج من خلال متفاوتة القيمة كما هو موضح أعلاه ، ثبت أن النموذج الصحيح ملزمة لالجميح للسيارات (6 ') ، الثاني هو نموذج ثنائي موقع ملزمة متسلسلة. هنا ، نحن تصف الخطوات التي يجب اتخاذها عند إجراء التجارب في مركز التجارة الدولية من أجل الحصول على مجموعات البيانات المناسبة للمتغير ج التحليلات.
Protocol
Discussion
لقد كان هذا الجزء التحليلي من متغير ج تركيب سبق وصفها بالتفصيل 10. نحن هنا التقرير الجوانب العملية لجمع قواعد البيانات متغيرة ج مناسبة لهذا النهج. فمن الضروري أن يتم سحب جميع البروتين وعينات من يجند حلول بنفس الرصيد. ولذلك فمن المهم أن يتم تحضير محلول المخزون كاف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) ، الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث (NSERC) ، ومنحة دراسية للتدريب CIHR (لLF). نشكر الأستاذ جيرار دي رايت (جامعة ماكماستر ، كندا) لالجميح للسيارات (6) – II التعبير البلازميد.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetyl coenzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | ||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher | 7365-45-9 | ||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | ||
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | ||
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR | 281445-477 | ||
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman | 7184-004 | ||
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements | |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
- Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
- Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
- Okhrimenko, O. k. s. a. n. a., J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
- Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -. N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
- Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
- Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
- Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -. a., Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
- Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6′)-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).
- Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
- MicroCal. . ITC Data Analysis in Origin. , (2004).
