Coleta variável concentração Datasets Calorimetria Isotérmica de Titulação a fim de determinar mecanismos de ligação

Summary

ITC é uma ferramenta poderosa para estudar a ligação de um ligante para seu hospedeiro. Em sistemas complexos no entanto, vários modelos podem ajustar os dados igualmente bem. O método descrito aqui fornece um meio para elucidar o modelo de encadernação adequada para sistemas complexos e extrair os parâmetros termodinâmicos correspondentes.

Abstract

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é comumente usada para determinar os parâmetros termodinâmicos associados com a ligação de um ligante para uma macromolécula host. ITC tem algumas vantagens sobre abordagens comuns espectroscópicas para o estudo de host / ligante interações. Por exemplo, o calor liberado ou absorvido quando os dois componentes interagem é medido diretamente e não requer qualquer repórteres exógena. Assim, a entalpia de ligação ea constante de associação (Ka) são obtidos diretamente a partir de dados ITC, e pode ser usado para calcular a contribuição entrópica. Além disso, a forma da isoterma é dependente do c-valor e do modelo mecanicista envolvidos. O c-valor é definido como n = c [P] TKA, onde [P] t é a concentração de proteína, e n é o número de sites de ligação do ligando dentro do hospedeiro. Em muitos casos, vários sítios de ligação para um ligante dadas não são equivalentes e ITC permite a caracterização dos parâmetros termodinâmicos de ligação para cada site individual vinculativo. Este, porém, exige que o modelo correto de ligação ser usado. Essa escolha pode ser problemático se os diferentes modelos podem caber os mesmos dados experimentais. Nós temos mostrado previamente que este problema pode ser contornado através da realização de experimentos em vários c-valores. As isotermas múltiplos obtidos em diferentes valores de c estão aptos simultaneamente a modelos distintos. O modelo correto é o próximo identificados com base na bondade de ajuste em todo o conjunto de dados variável c-inteiro. Este processo é aplicado aqui para o aminoglicosídeo resistência causando aminoglicosídeo enzima N-6'-acetiltransferase-Ii (AAC (6 ')-II). Embora nossa metodologia é aplicável a qualquer sistema, a necessidade dessa estratégia é melhor demonstrada com um sistema de macromolécula-ligante mostrando allostery ou cooperatividade, e quando diferentes modelos de ligação fornecer cabe essencialmente idênticos aos mesmos dados. Ao nosso conhecimento, não existem tais sistemas disponíveis comercialmente. AAC (6 ')-II, é um homo-dímero contendo dois sítios ativos, mostrando cooperatividade entre as duas subunidades. Contudo, os dados obtidos ITC em um único c valor pode ser apto igualmente bem a pelo menos dois modelos diferentes de um modelo de dois conjuntos-de-sites independentes e um dois-site seqüencial modelo (cooperativa). Através da variação da c-valor, como explicado acima, estabeleceu-se que o modelo correto de ligação para AAC (6 ')-II é um dois-site modelo seqüencial de ligação. Aqui, descrevemos os passos que devem ser tomados ao realizar experimentos ITC para obter conjuntos de dados adequados para a variável-c análises.

Protocol

1. Preparar soluções estoque Purificar a macromolécula de interesse. (Neste caso, aminoglicosídeo N-6'-acetiltransferase-Ii (AAC6'-II), é isolada como relatado em outros lugares. 13) Prepare 4 litros de solução de diálise. (Neste caso foi utilizado 25 mM 4 – (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, 238,3 MW g / mol), contendo 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 292,2 MW), no pH 7,5). Diálise a proteína A AAC amostra (6 ')-II (5…

Discussion

Esta parte analítica da variável c montagem foi descrito anteriormente em detalhe ^10. Aqui relatamos os aspectos práticos da coleta variável c conjuntos de dados adequados para esta abordagem. É essencial que todas as proteínas e as amostras de ligante são desenhados a partir das soluções estoque mesmo. Portanto, é importante que a solução estoque suficiente é preparado inicialmente para completar toda a série de experimentos. Isso garante que o rácio de AAC (6 ')-II e AcCoA é constante en…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Acetyl coenzyme A (AcCoA)		Sigma-Aldrich	A2056
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)		Fisher	7365-45-9
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)		Sigma-Aldrich	431788
Spectra/Por 2 Dialysis Tubing		Spectrum Labs	132678
Sterile Syringe Filter (0.2 μm)		VWR	281445-477
Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm)		Whatman	7184-004
VP-ITC		MicroCal	VP-ITC	Microcalorimeter used for measurements
ThermoVac		MicroCal	USB Thermo Vac	Temperature Controlled Degassing Station