Samla Variable-koncentration Isotermiska Dataset Titrering Calorimetry för att fastställa bindande mekanismer
Summary
ITC är ett kraftfullt verktyg för att studera bindningen av en ligand till sin värd. I komplexa system kan dock flera modeller passar data lika bra. Den metod som beskrivs här ger en möjlighet att belysa lämplig bindande modell för komplexa system och extrahera motsvarande termodynamiska parametrar.
Abstract
Isotermisk titrering kalorimetri (ITC) är vanligen används för att bestämma termodynamiska parametrar i samband med bindning av en ligand till en värd makromolekyl. ITC har vissa fördelar jämfört med vanliga spektroskopiska metoder för att studera värd / ligand interaktioner. Till exempel är den värme som frigörs eller absorberas när de två komponenterna samverkar direkt mätt och kräver inte någon exogen reportrar. Således bindande entalpi och föreningen konstant (Ka) är direkt från ITC data och kan användas för att beräkna entropiska bidrag. Dessutom är formen på isotermen beroende av c-värde och mekanistiska modellen inblandade. C-värde definieras som c = n [P] TKA, där [P] t är det protein koncentrationen, och n är antalet ligandbindande platser i värden. I många fall flera bindningsställen för en viss ligand är icke-likvärdiga och ITC tillåter karakteriseringen av termodynamiska bindande parametrar för varje enskild bindningsställe. Detta kräver dock att den korrekta bindande mallen användas. Detta val kan vara problematiskt om olika modeller kan passa samma experimentella data. Vi har tidigare visat att detta problem kan kringgås genom att utföra experiment på flera c-värden. De många isotermer erhålls vid olika c-värden är lämpliga samtidigt till separata modeller. Rätt modell är nästa identifieras utifrån godhet passar hela variabel c dataset. Denna process som här tillämpas på aminoglykosid-resistens vilket enzym aminoglykosid N-6'-acetyltransferas-II (AAC (6 ')-II). Även om vår metodik är tillämplig på alla system, är nödvändigheten av denna strategi bättre visats med en makromolekyl-ligand som visar allostery eller kooperativitet, och när olika bindande modeller ger i stort sett identisk passar till samma data. Så vitt vi vet, det finns inga sådana system kommersiellt tillgänglig. AAC (6 ')-II, är en homo-dimer som innehåller två aktiva webbplatser, visar kooperativitet mellan de två subenheter. Men ITC uppgifter som erhållits vid en enda C-värde kan passa lika bra till minst två olika modeller i två set-av-sajter oberoende modell och en två-site sekventiell (kooperativ) modell. Genom att variera C-värdet som anges ovan konstaterades det att rätt bindande modell för AAC (6 ')-II är en två-site sekventiella bindande mallen. Häri beskriver vi de steg som måste tas när du utför ITC experiment för att erhålla dataset som lämpar sig för rörlig-c analyser.
Protocol
Discussion
Denna analytiska delen av variabel c montering har tidigare beskrivits i detalj 10. Här rapporterar vi de praktiska aspekterna av att samla in variabla c datamängder lämplig för detta synsätt. Det är viktigt att alla proteiner och prover liganden är hämtade från samma bestånd lösningar. Därför är det viktigt att tillräckliga stamlösning är beredd initialt att fullfölja hela serien av experiment. Detta säkerställer förhållandet AAC (6 ')-Ii och AcCoA är konstant bland alla experiment…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR), National Science and Engineering Research Council (NSERC), och en CIHR utbildningsstipendium stipendium (till LF). Vi tackar Prof. Gerard D. Wright (McMaster University, Kanada) för AAC (6)-Ii uttryck plasmid.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetyl coenzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | ||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher | 7365-45-9 | ||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | ||
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | ||
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR | 281445-477 | ||
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman | 7184-004 | ||
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements | |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
- Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
- Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
- Okhrimenko, O. k. s. a. n. a., J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
- Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -. N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
- Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
- Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
- Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -. a., Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
- Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6′)-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).
- Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
- MicroCal. . ITC Data Analysis in Origin. , (2004).
