Sammeln Variable-Konzentration Isotherme Titrationskalorimetrie Datasets in Auftrag, um bindende Mechanismen bestimmen
Summary
ITC ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Bindung eines Liganden an seinen Wirt. In komplexen Systemen kann jedoch mehrere Modelle die Daten gleich gut passen. Die hier beschriebene Methode bietet eine Möglichkeit, die entsprechende Bindung Modell für komplexe Systeme aufzuklären und extrahieren Sie die entsprechende thermodynamische Parameter.
Abstract
Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) wird häufig verwendet, um die thermodynamischen Parameter der Bindung eines Liganden an einen Host-Makromolekül verbunden zu bestimmen. ITC hat einige Vorteile gegenüber gängigen spektroskopischen Methoden zur Untersuchung von Host / Ligand-Wechselwirkungen. Zum Beispiel wird die freiwerdende Wärme oder absorbiert wird, wenn die beiden Komponenten interagieren direkt gemessen und erfordert keine exogenen Reporter. So ist die Bindungsenthalpie und der Assoziationskonstante (Ka) werden direkt von ITC-Daten erhalten, und kann verwendet werden, um die entropische Beitrag berechnen. Darüber hinaus ist die Form der Isotherme abhängig von der c-Wert und die mechanistischen Modell beteiligt. Die c-Wert ist definiert als c = n [P] TKA, wobei [P] t ist die Protein-Konzentration und n die Anzahl der Liganden-Bindungsstellen innerhalb der Host. In vielen Fällen sind mehrere Bindungsstellen für einen bestimmten Liganden nicht gleichwertig und ITC ermöglicht die Charakterisierung des thermodynamischen Bindungsparameter für jedes einzelne Bindungsstelle. Dies erfordert jedoch, dass die korrekte Bindung Modell verwendet werden. Diese Wahl kann problematisch sein, wenn verschiedene Modelle der gleichen experimentellen Daten passen. Wir haben bereits gezeigt, dass dieses Problem durch die Durchführung von Experimenten an mehreren c-Werte können nicht umgangen werden. Die multiple Isothermen bei verschiedenen c-Werte erhalten werden gleichzeitig verschiedene Modelle passen. Das richtige Modell ist neben basierend auf die Güte der Anpassung über die gesamte variable-c Datensatz identifiziert. Dieser Prozess ist hier, um die Aminoglykosid-Resistenz verursachenden Enzym Aminoglycosid N-6'-Acetyltransferase-II (AAC (6 ')-II) beantragt. Obwohl unsere Methode ist anwendbar auf jedem System, ist die Notwendigkeit, diese Strategie besser mit einem Makromolekül-Ligand-System zeigt Allosterie oder Kooperativität gezeigt, und wenn verschiedene verbindliche Modelle bieten im Wesentlichen identisch passt auf die gleichen Daten. Nach unserer Kenntnis gibt es keine derartigen Systeme im Handel erhältlich. AAC (6 ')-II ist ein Homo-Dimer mit zwei aktiven Zentren, welche Kooperativität zwischen den beiden Untereinheiten. Allerdings ITC-Daten an einem einzigen c-Wert erhalten kann ebenso gut fit sein, um mindestens zwei verschiedene Modelle einer Zwei-sets-of-Sites eigenständiges Modell und eine Zwei-Seiten sequentielle (Genossenschaft) Modell. Durch Variation der c-Wert wie oben erläutert, wurde festgestellt, dass die korrekte Bindung Modell für AAC (6 ')-II a two-site sequenzielle Bindung Modell ist. Hier beschreiben wir die Schritte, die bei der Durchführung von ITC Experimenten werden, um Datensätze für variable-c-Analysen erhalten müssen.
Protocol
Discussion
Diese analytische Teil der variablen c Montage wurde bereits im Detail 10 beschrieben. Hier berichten wir über die praktischen Aspekte des Sammelns variable-c-Datensätze für diesen Ansatz. Es ist wichtig, dass alle Protein und Ligand Proben aus dem gleichen Stammlösungen gezogen werden. Deshalb ist es wichtig, dass genügend Stammlösung wird zunächst die gesamte Reihe von Experimenten vollständig vorbereitet. Dadurch wird sichergestellt, das Verhältnis von AAC (6 ')-II und AcCoA ist bei allen Expe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research (CIHR), National Science and Engineering Research Council (NSERC) und eine CIHR Ausbildungsförderung Stipendium (LF) unterstützt. Wir danken Prof. Gerard D. Wright (McMaster University, Kanada) für den AAC (6)-Ii Expressionsplasmid.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetyl coenzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | ||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher | 7365-45-9 | ||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | ||
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | ||
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR | 281445-477 | ||
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman | 7184-004 | ||
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements | |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
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