Разбор и Окрашивание Drosophila Личинок Яичники
Summary
Как ниши и стволовые клетки образуются во время развития является важным вопросом практические последствия. В<em> Drosophila</em> Яичников, зародышевой линии стволовых клеток и их соматического ниши форме в течение личиночного развития. Это видео демонстрирует, как до расчленения, пятна и смонтировать женщин гонады с конца третьего возраста (LL3)<em> Drosophila</em> Личинок.
Abstract
Многие органы зависят от стволовых клеток для их развития в период эмбриогенеза и для технического обслуживания или ремонта в течение взрослой жизни. Понимание того, как стволовые клетки образуются, и как они взаимодействуют с окружающей их средой Поэтому крайне важно для понимания развития, гомеостаза и болезни. Яичник плодовой мушки дрозофилы служил влиятельной моделью для взаимодействия зародышевой линии стволовых клеток (GSCs) с их соматических клетках поддержки (ниши) 1, 2. Известно расположение нишу и GSCs, в сочетании со способностью к генетически манипулировать ими, позволило исследователям выяснить различных взаимодействий между стволовыми клетками и их ниши 3-12.
Несмотря на огромное количество информации о механизмах управления GSC обслуживания и дифференциацию, относительно мало известно о том, как GSCs и их соматической форме ниши в процессе разработки. Около 18 соматических ниши, которых клеточные компоненты включают нити терминала и крышка клетки (рис. 1), форму в течение третьего личиночного возраста 13-17. GSCs происходят из первичных половых клеток (PGCs). PGCs размножаться на ранних личиночных стадиях, но после образования нишу подгруппе PGCs становится GSCs 7, 16, 18, 19. Вместе нишу соматических клеток и GSCs сделать функциональный блок, который производит яйца в течение всей жизни организма.
Многие вопросы, касающиеся образования GSC единицы остаются без ответа. Такие процессы, как координация между клеток-предшественников для ниш и прекурсоров стволовых клеток, или поколение асимметрии в PGCs, поскольку они становятся GSCs, наилучшим образом может быть изучен в личинку. Тем не менее, методические исследования личиночного развития яичников физически сложно. Во-первых, личиночной яичников малы. Даже в конце личиночной стадии они только 100 мкм в диаметре. Кроме того, яичники являются прозрачными и встроены в белый жир тела. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол для выделения яичниками с конца третьего возраста (LL3) Drosophila личинки, после окрашивания с флуоресцентными антителами. Мы предлагаем некоторые технические решения проблем, таких как размещение яичников, окрашивания и стирки тканей, которые не тонут, и убедившись, что антитела проникают в ткани. Этот протокол может быть применен к ранее личиночной стадии и личиночной яички, а также.
Protocol
Discussion
Это видео демонстрирует изоляции и окраске протокол конце третьего возраста яичники личиночной. Для выполнения этого протокола в плановом порядке и надежно, следует обратить внимание на следующие моменты:
- Для синхронизации и хорошо развитые личинки, за скученности следует изб…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
И. М. поддерживается Мари Кюри реинтеграции гранта. Эта работа была поддержана Израиль науке нет фонда Грант. 1146/08, по Хелен и Мартина Киммел Институт Исследования стволовых клеток в Институт Вейцмана и Лир благотворительный фонд.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | J.T.Baker | |||
| Kcl | Merck | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| MgCl2 | Merck | |||
| Sucrose | J.T.Baker | |||
| Hepes | Sigma-Aldrich | |||
| PBS | Sigma-Aldrich | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | |||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | ||
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | FST Fine Science Tools | 11295-10 | ||
| Nickel plated pin holder | FST Fine Science Tools | 26018-17 | ||
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | FST Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | CORNING | 7220-85 | ||
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica | |||
| 6 well plates | Costar | 3516 | ||
| Slides | Menzel Glaser GmbH | 798 | ||
| Cover slips | Corning | 2940-223 | ||
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | ||
| Cell strainer | Falcon | FAL352350 | ||
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | |||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | |||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | |||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | |||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
