تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em
Summary
في هذا البروتوكول التعبير الجيني ، في الخميرة (<em> السكيراء الجعوية</em>) هو تغير بعد التعرض لالاكسدة التي تسببها إضافة بيروكسيد الهيدروجين (H<sub> 2</sub> O<sub> 2</sub>) ، عامل مؤكسد.
Abstract
في هذا البروتوكول ، ويتم تغيير الجينات في الخميرة (خميرة السكيراء) بعد التعرض لالاكسدة التي تسببها إضافة بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) ، وعامل مؤكسد. في التجربة ، ويزرع الخميرة لمدة 48 ساعة في مرق YPD 1/2X تحتوي على الجلوكوز 3X. يتم تقسيم الثقافة الى مجموعة المراقبة والمعالجة. يتم التعامل مع الثقافة التجربة مع 0.5 مم H 2 O 2 هانكس في التخزين المؤقت المالحة (HBSS) لمدة 1 ساعة. يتم التعامل مع سيطرة ثقافة HBSS فقط. يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من كل الثقافات ويتم تحويلها إلى البيوتين المسمى كرنا المنتج من خلال عملية متعددة الخطوات. أخذ المنتج التجميع النهائي مرة أخرى إلى الأساسية UVM مرفق ميكروأري والمهجنة للGeneChips Affymetrix الخميرة. يتم تحميلها على التعبير الجيني البيانات الناتجة في صناعة البرمجيات المعلوماتية الحيوية تحليل البيانات.
Protocol
<p class="jove_title"> 1. عزل الحمض النووي الريبي من المجموع<em> السكيراء الجعوية</em> باستخدام تحلل الأنزيمية</p><ol><li> إعداد منطقة خالية من ريبونوكلياز العمل به ريبونوكلياز ZAP (Ambion).</li><li> تحضير كاشف lyticase عمل جديدة عن طريق إضافة 1 مل من الماء الخالي من ريبونوكلياز مباشرة إلى القارورة lyticase لجعل الحل النهائي العاملة من 10 U / UL. دوامة جيدا وعكس عدة مرات لضمان خلط كاملة. هذه الوحدات 10 / ميكرولتر حل ثابت لمدة 12 ساعة.</li><li> إعداد الطازجة الحل الأول باستخدام الدناز الدناز Qiagen عدة وتخزينها على الجليد.</li><li> تسمية microcentrifuge 1.7 مل أنبوب بمعلومات عن هوية الخاص. نقل 1.5 مل من الثقافة الخميرة المناسبة في الأنبوب.</li><li> جهاز طرد مركزي في الأنبوب XG 5000 (حوالي 3 / 4 سرعة كاملة) لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية طاف (بدون بيليه مزعجة) باستخدام micropipette وتجاهل طاف.<strong>**** كرر الخطوة 4 إذا كان بيليه هو حجم صغير جدا أو إذا أشار إليه المدرب.****</strong</li><li> إضافة الماء 1000 DEPC ميكرولتر لبيليه ، الدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 2 دقيقة. تجاهل طاف. إزالة أكبر قدر من السائل ممكن من بيليه الخميرة.</li><li> إضافة إلى ما يلي بيليه الخميرة ودوامة لالمزيج.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> SGbuffer</td><td> 10 ميكرولتر</td></tr><tr><td> Lyticasesolution (10u/μl)</td><td> 30 ميكرولتر</td></tr></tbody></table</li><li> احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li><li> برفق دوامة أنبوب كل 10 دقائق لتوليد spheroplasts. يجب التعامل Spheroplasts بلطف. دراسة الخميرة تحت المجهر لمراقبة spheroplasting كاملة. في حين أن دراسة الخميرة على الشريحة المجهر ، إضافة كمية صغيرة من 0.1 ٪ SDS يسبب الانتفاخ والخميرة إلى النموذج المثالي المجالات (حتى للخلايا في مهدها). هذا يشير إلى أنه تم هضم جدران الخلية.</li><li> أضف ب 350 ميكرولتر – RLT العازلة للأنابيب والدوامة<strong> بقوة</strong> ل1 دقيقة. مغلق بإحكام ضمان توج الأنبوب الخاص من خلال عقد الغطاء بينما vortexing. وهذا الإجراء في spheroplasts ليز.</li><li> أضف 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ في أنبوب ودوامة لفترة وجيزة. قد يعجل النموذج بعد إضافة الإيثانول ، ولكن هذا لن يؤثر على جمع الحمض النووي الريبي.</li><li<strong> تجميع الحمض النووي الريبي :</strong> informationand تسمية عمود الدوران RNeasy مع تحديد بعناية نقل كل حل من خطوة 10 الى عمود الدوران باستخدام micropipette. يجب الحرص على عدم لمس الغشاء السيليكا مع طرف الماصة. إغلاق أنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية بسرعة كاملة. والحمض النووي الريبي في العينة التمسك غشاء السيليكا لعمود الدوران.</li><li> إزالة عمود الدوران من أنبوب جمع. الماصة للتمرير من خلال السائل (السائل في أنبوب جمع) مرة أخرى على عمود الدوران والطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل أنبوب جمع (مع تدفق السوائل من خلال) ومكان العمود تدور في أنبوب جمع الجديد 2 مل.</li><li> أضف 350 ميكرولتر RW1 عازلة لعمود الدوران. ويستخدم هذا الحل لغسل وإزالة أملاح الحمض النووي الريبي والحطام الخلوية الذائبة. إغلاق أنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية بسرعة كاملة.</li><li<strong> هضم الحمض النووي :</strong> إزالة عمود الدوران من أجهزة الطرد المركزي ، وفتح غطاء أنبوب وإضافة 80 ميكرولتر من محلول أنا الدناز إلى منتصف تدور غشاء العمود. هذه الخطوة سوف هضم أي gDNA في العينة. إغلاق غطاء عمود ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li><li> نقل عمود الدوران إلى أنبوب جمع الجديد 2 مل.</li><li<strong> تنظيف وغسل RNA :</strong> أضف 350 ميكرولتر RW1 العازلة للعمود دوران أجهزة الطرد المركزي وبأقصى سرعة لمدة 15 ثانية.</li><li> تجاهل أنبوب جمع ومكان العمود تدور في أنبوب جمع الجديد 2 مل.</li><li> إضافة 500 العازلة RPE ميكرولتر إلى عمود الدوران لغسل الحمض النووي الريبي على الغشاء السيليكا. إغلاق أنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية بسرعة كاملة<em>.</em</li><li> تجاهل أنبوب جمع ومكان العمود تدور في أنبوب جمع الجديد 2 مل.</li><li> اغسل الغشاء السيليكا مرة أخرى وذلك بإضافة 500 ميكروليتر RPE العازلة للعمود الدوران. إغلاق أنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية بسرعة كاملة.</li><li> ضع عمود جديد تدور في 2 مل أنبوب جمع وأجهزة الطرد المركزي في microcentrifuge بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة لضمان إزالة أي السائل المتبقية من غشاء السيليكا.</li><li<strong> استرداد الحمض النووي الريبي :</strong> نقل العمود تدور RNeasy إلى 1.7 مل أنبوب جديد microcentrifuge التي تم المسمى مع المعلومات عينتك. لاحظ أنه سيتم ترك غطاء للأنبوب جديد لفتح الخطوات القليلة المقبلة.</li><li> بعناية الماصة 30 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه<strong> مباشرة على مركز</strong> الغشاء السيليكا.<strong> لا تلمس غشاء السيليكا مع طرف الماصة (انظر الرسم البياني)</strong>. كما كنت تبحث عن كثب تنفيذ هذه الخطوة. استخدام كلتا اليدين لتوجيه الماصة. تأكد يتم توزيعها بالتساوي على المياه على الغشاء.</li><li> احتضان عمود الدوران في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية.</li><li> نقل بعناية ميكرولتر 30 التي يتم استردادها في أنبوب 1.7 مل مرة أخرى إلى مركز للغشاء السيليكا لعمود الدوران نفسه كما في الخطوة 22 أعلاه. مكان العمود مرة أخرى في نفس 1.7 مل أنبوب جمع واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بسرعة كاملة. هذا شطف مزدوجة تؤمن أن يتم استرداد المبلغ الأقصى من الحمض النووي الريبي من الغشاء.</li><li> تسمية جديدين microcentrifuge 1.7 مل أنابيب بمعلومات عن هوية الخاص ونقل كل من عينة الحمض النووي الريبي لاسترداد واحدة من هذه الأنابيب.</li><li> نقل 4 ميكرولتر من هذه العينة إلى الأنبوب الآخر المسمى. وسيتم نقل هذه العينة مرة أخرى إلى لUVM Nanodrop الكمي والتقييم النوعي الحمض النووي الريبي (وهذا هو الحمض النووي الريبي للتحقق من صحة التحليل الكمي والنوعي في أداء المشاركين على موقع المعهد).</li><li> وضع كافة العينات في الثلج.</li><li<strong> RNA الكمي :</strong> استخدام مقياس التكيف للظلام إيبندورف ، وقياس الامتصاصية للعينة الحمض النووي الريبي على معمل في مخفف 1 إلى 50 (1μl عينة 49μl + H<sub> 2</sub> O).</li><li> تقييم الجودة باستخدام الحمض النووي الريبي E – جل (Invitrogen) 1.2 ٪ هلام agarose الجاهزة للالكهربائي.</li><li<strong> RNA التحليل النوعي :</strong> إعداد الجهاز الكهربائي E – هلام. قبل تشغيل هلام لمدة 2 دقيقة وفقا للإجراءات الشركة المصنعة. بعد تشغيل مسبقا ، إزالة المشط جل وإضافة 14 ميكرولتر من المياه لكل اتباعها بشكل جيد من قبل 1μl من كل عينة إلى كل بئر. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. استخدام الحمض النووي الحجم المناسب سلم في بئر واحدة في وقت لاحق للمقارنة بحجم (سلم لي سهلة BioLine حجم قياسي أو علامة Novagen PCR). السجل الذي العينة في كل حارة. تشغيل الجل لمدة 20 دقيقة.</li><li> التقط صورة للهلام.</li></ol><p class="jove_title"> 2. أول تخليق ستراند [كدنا]</p><ol><li> تسمية 0.5 مل أنبوب PCR بمعلومات عن هوية الخاص. من تركيز الحمض النووي الريبي تحديد من التجربة المذكورة أعلاه ، وحساب حجم العينة للحصول على 3.0 ميكروغرام. نقل هذا المبلغ إلى الأنبوب. إضافة ما يكفي من الماء الخالي من ريبونوكلياز لتحقيق وحدة التخزين إلى المجاهدين 11.0.</li><li> إضافة 1.0 ميكرولتر T7 بنسبة ضئيلة (DT)<sub> 24</sub> كاشف إلى الأنبوب. تأكد من أن تولي اهتماما خاصا لحجم طرف الماصة خلال هذه الخطوة لضمان نقل جميع الكاشف. دوامة أنبوب الطرد المركزي وبأقصى سرعة لمدة 5 ثوان. وضع أنبوب في thermocycler حددت في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.</li><li> في حين أن 70 حضانة درجة مئوية في التقدم ، وإعداد سيد الشكل الأول المزيج في أنبوب جديد. تأكد من إضافة الكواشف التالية<strong> في النظام ،</strong> دوامة الطرد المركزي وبأقصى سرعة لمدة 5 الثانية ووضع أنبوب على الجليد.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> الرئيسية حبلا الأولى مزيج :</strong</td></tr><tr><td> FirstStrandBuffer5X</td><td> 4 ميكرولتر</td></tr><tr><td> 0.1MDTT</td><td> 2 ميكرولتر</td></tr><tr><td> 10mMdNTP</td><td> 1 ميكرولتر</td></tr><tr><td> SuperscriptII</td><td> 1 ميكرولتر</td></tr></tbody></table<br /> استخدم micropipette P2 لقياس كميات من 2 ميكرولتر أو أقل.</li><li> بعد 70 درجة مئوية حضانة في الخطوة 2 كاملة ، إضافة 8 ميكرولتر من مزيج حبلا الرئيسية الأولى في الخطوة 3 إلى الأنبوب واحتضانها في thermocycler على 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. عندما يتم تجميع المركز الاول حضانة حبلا ، ضع أنبوب على الجليد. خلال هذه الحضانة ، وإعداد سيد الشق الثاني المزيج.</li></ol><p class="jove_title"> 3. الثانية التجميعي ستراند [كدنا]</p><ol><li> الرئيسية التالية جعل الشق الثاني المزيج في أنبوب جديد. يبقيه على الجليد. دوامة وجميع أجهزة الطرد المركزي قبل استخدام الكواشف. إضافة الكواشف المدرجة في الترتيب.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> الرئيسية حبلا الثانية مزيج</strong</td></tr><tr><td> DEPC المياه</td><td> 91 ماي</td></tr><tr><td> 5X الاحتياطي ستراند الثانية</td><td> 30 ماي</td></tr><tr><td> dNTPs (10MM)</td><td> 3 UL</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> يغاز الحمض النووي (10U/ul)</td><td> 1 UL</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> أنا DNA بوليميريز (10U/ul)</td><td> 4 UL</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> ريبونوكلياز H (2U/ul)</td><td> 1 UL</td></tr></tbody></table</li><li> دوامة الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 ثوان بأقصى سرعة.</li><li> عند انتهاء الحضانة 42 درجة مئوية ، ونقل جميع ميكرولتر 130 من مزيج حبلا الرئيسي الثاني للأنبوب عينة تحتوي على الحمض النووي الريبي والكواشف حبلا الأول. دوامة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 ثوان في درجة حرارة الغرفة. احتضان الأنبوب لمدة 2 ساعة على 16 درجة مئوية في thermocycler.</li><li> في نهاية الحضانة 2 ساعة وبينما لا يزال في العينة 16 درجة مئوية ، إضافة 2μl بوليميريز الحمض النووي T4 كاشف إلى الأنبوب. وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة دوامة أنبوب واحتضان 16 درجة مئوية في مدة لا تزيد عن 5 دقائق إضافية. قد تحتضن أطول مدة 5 دقائق ثم تقلل من نوعية [كدنا] بسبب نشاط 5'exonuclease 3'to للبوليميريز T4.</li><li> في نهاية الحضانة 5 دقائق ، يضاف 10 ميكرولتر 0.5 M EDTA لوقف بوليميريز الحمض النووي T4 التفاعل. تخزين في أنبوب -20 درجة مئوية.</li></ol><p class="jove_title"> 4. عجل [كدنا]</p><ol><li> جهاز طرد مركزي جل قفل أنبوب المرحلة بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة لضمان الجل في الجزء السفلي من الأنبوب.<strong> لا الدوامه أنابيب المرحلة LOCK</strong>.</li><li> إضافة ميكرولتر من 162<strong> أسفل طبقة</strong> من الحموضة مخزنة 8.0 تريس الفينول / الكلوروفورم / كحول أيزو أميلي (PCI) لمحتويات حبلا [كدنا] second التوليف أنبوب التفاعل ودوامة لمدة 5 ثوان لخلط محتويات (إجمالي حجم الخطوة التوليف [كدنا] من التجربة المذكورة أعلاه هو 162 UL. الخطوة PCI يتطلب كميات متساوية من خليط المائي والعضوي).</li><li> نقل جميع الخليط [كدنا] – PCI إلى هلام الانبوب مرحلة القفل باستخدام micropipet.<strong> لا الدوامه</strong> قفل المرحلة أنبوب هلام.</li><li> الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة.</li><li> تسمية جديدة microcentrifuge 1.7 مل الأنبوب. استخدام micropipet لنقل الطبقة العليا من هلام المرحلة قفل أنبوب إلى أنبوب المسمى حديثا مل 1.7. في محاولة لجمع أكبر قدر من طبقة ممكن.</li><li> إضافة إلى ما يلي الأنبوب مل microcentrifuge 1.7 و دوامة.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> الإيثانول (100 ٪)</td><td> 405 UL</td></tr><tr><td> NH<sub> 4</sub> OAC</td><td> 80 ماي</td></tr><tr><td> بيليه الرسام</td><td> 1 UL</td></tr></tbody></table</li><li> ضع في أنبوب الطرد المركزي مع المفصلي للأنبوب الطرد المركزي التي تواجه بها وبأقصى سرعة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li><li> إزالة برفق أنبوب من أجهزة الطرد المركزي والحرص على عدم تعكير صفو بيليه [كدنا]. يجب أن تكون وردية وبيليه تقريبا بحجم حبة الملح ، وعلى جانب من أنبوب تحت المفصلي. مكان على الجليد والشروع فورا في الخطوة التالية.</li></ol><p class="jove_title"> 5. تنظيف بيليه [كدنا]</p><ol><li> استخدام micropipet P1000 ، إزالة بعناية كافة طاف من الأنبوب. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. نتذكر أن بيليه هو نموذج الخاص بك!</li><li> إضافة 500μl الباردة الايثانول 80 ٪ (-20 المخزنة في<sup> ·</sup> C الفريزر) إلى الأنبوب. غطاء الأنبوب برفق وعكس ذلك عدة مرات ببطء. مشاهدة بيليه الخاص بشكل وثيق جدا. إذا كان بيليه يصبح منفصلة ، ضع الأنبوب مرة أخرى في الرف وترك بيليه تترسب في القاع. بالتناوب ، قد الطرد المركزي أنبوب بأقصى سرعة لمدة 15 ثانية لتحصل على بيليه التراجع إلى أسفل الأنبوب.</li><li> استخدام micropipet P1000 ، إزالة بعناية الايثانول يجري حريصا جدا على ألا تخل بيليه. غيض أنبوب لتمكين إزالة كسائل أقصى حد ممكن.</li><li> كرر الخطوات 2 و 3 مع قسامة جديدة من الايثانول 80 ٪.</li><li> وأخيرا ، وإزالة كافة الايثانول ممكن باستخدام micropipet P1000. أنبوب الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 5 ثوان ، وباستخدام micropipet P20 ، إزالة microliters القليلة الماضية من الايثانول. والهدف من ذلك هو إزالة أكبر قدر ممكن من الايثانول من دون إزعاج بيليه.</li><li> ضع أنبوب فتح في رفوف أو مربع التجفيف لمدة 10-20 دقيقة حتى يتبخر الإيثانول المتبقية. وخسر بسهولة بيليه المجففة حالما يتم الجافة. Becareful للتعامل مع أنبوب بلطف. عند الانتهاء ، أغلق الغطاء. تصور بيليه المجففة لتأكيد أنها موجودة في الأنبوب.</li><li> Resuspend لبيليه في 22 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه ووضع أنبوب على الجليد.</li></ol><p class="jove_title"> 6. InVitroTranscription (IVT)</p><ol><li> وbioarray ENZO عدة تحتوي على كافة الكواشف اللازمة لإعداد البيوتين المسمى كرنا من [كدنا].<br /وسوف> A mixfor الرئيسية سوف تكون على استعداد الطبقة كلها ومدرب follows.The إعداد هذا المزيج أو تعيين شخص من فئة. يجب أن يتم ذلك في منطقة خالية من ريبونوكلياز.<br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> AMT / عينة</td><td> # عينات</td><td> المجموع</td></tr><tr><td> الكاشف 1 [العازلة الرد 10X]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> الكاشف 2 [Biotinnucleotides 10X]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> الكاشف 3 [DTT 10X]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> الكاشف 4 [المانع ريبونوكلياز 10X]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> الكاشف 5 [20X T7 بوليميريز RNA]</td><td> 2μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> المجلد المجموع</td><td> 18 ميكرولتر</td><td></td><td></td></tr></tbody></table<br /><strong> ملاحظة :</strong> اعداد كافية مزيج رئيسية لعدد من العينات زائد واحد. وهذا يكفي لتأمين أغراض pipetting.</li><li> تسمية 0.5 مل أنبوب PCR. الجمع بين التالية في أنبوب والماصة عدة مرات وتصل إلى أسفل إلى المزيج. تدور في جهاز للطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 5 ثوان للحصول على كل الكواشف إلى أسفل الأنبوب.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> خليط [كدنا]</td><td> 22μl</td></tr><tr><td> Enzomastermix [fromabove]</td><td> 18μl</td></tr><tr><td> TotalVolume</td><td> 40μl</td></tr></tbody></table</li><li> احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية في ساعات for16 thermocycler. رد الفعل عند اكتمال تخزين العينة في -20 درجة مئوية</li></ol><p class="jove_title"> 7. تنظيف كرنا Biotinylated</p><ol><li> نقل العينة كرنا بأكمله إلى 1.7 مل أنبوب جديد microcentrifuge. إضافة 60 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه و 350 العازلة RLT ميكرولتر ودوامة لمدة 5 ثوان.</li><li> أضف 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ والدوامة من جديد.</li><li> تسمية عمود الدوران RNeasy ونقل العينة كرنا بأكمله إلى العمود. يجب الحرص على عدم لمس طرف الماصة للغشاء السيليكا. إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية بسرعة كاملة.</li><li> إزالة عمود الدوران من أنبوب جمع. الماصة للتمرير من خلال السائل (السائل في أنبوب جمع) مرة أخرى على عمود الدوران والطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 ثانية.</li><li> ضع عمود الدوران في عالم جديد 2 مل أنبوب جمع والماصة 500 ميكرولتر من RPE العازلة على عمود الدوران. إغلاق أنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية بسرعة كاملة. جمع والتخلص من أنبوب يمر من خلال السائل. مكان العمود تدور في أنبوب جمع الجديد 2 مل.</li><li> إضافة 500 آخرين العازلة RPE ميكرولتر إلى عمود الدوران.</li><li> نقل العمود تدور في أنبوب المجموعة الجديدة وأداء عمود "التجفيف" تدور بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة.</li><li> تسمية جديدة microcentrifuge 1.7 مل أنبوب بمعلومات عن هوية الخاص. نقل العمود تدور في هذا الأنبوب.</li><li> الماصة 30 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من الماء على غشاء السيليكا واحتضان مركز RNeasy في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. إغلاق الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بسرعة كاملة.</li><li> نقل بعناية ميكرولتر 30 التي يتم استردادها في أنبوب 1.7 مل مرة أخرى إلى مركز للغشاء السيليكا RNeasy للعمود الدوران نفسه. مكان العمود مرة أخرى إلى نفس 1.7 مل أنبوب جمع واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بسرعة كاملة. هذا شطف مزدوجة تؤمن أن يتم استرداد المبلغ الأقصى للكرنا من الغشاء.</li><li> نقل هذا نظيفة البيوتين المسمى كرنا إلى 1.7 مل أنبوب جديد للطرد المركزي وتسمية مناسب.</li><li> تحديد تركيز كرنا باستخدام نفس الإجراء على النحو المبين أعلاه أثناء إجراءات عزل الحمض النووي الريبي. سجل التركيز ونسبة 260/280.</li></ol><p class="jove_title"> 8. تفتيت وكرنا لإعداد الهدف</p><ol><li> تسمية 0.5 مل أنبوب PCR بمعلومات عن هوية الخاص. نقل 5 ميكروغرام من المبلغ يعادل كرنا في أنبوب. إضافة ما يكفي من الماء الخالي من ريبونوكلياز لتحقيق الحجم الكلي ل16.0 المجاهدين ، ومن ثم إضافة 4.0 ميكرولتر من التشرذم 5X العازلة للأنبوب. ينبغي أن الحجم الإجمالي في أنبوب أن 20.0 المجاهدين.</li><li> دوامة الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية. احتضان الأنبوب في 94 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في thermocycler. وضعت على الجليد بعد الحضانة.</li></ol><p class="jove_title"> 9. تقييم مجزأة وغير مجزأة كرنا به جل Agarose</p><ol><li> إعداد الجهاز الكهربائي E – الجل باستخدام 1.2 ٪ هلام agarose الجاهزة. قبل تشغيل هلام لمدة 2 دقيقة وفقا لتوصية لتصنيع</li><li> أضف 14 ميكرولتر من الماء إلى كل بئر على هلام – E.</li><li> إضافة 2μl من كل عينة إلى كل بئر والماصة صعودا وهبوطا لمزيج جيد. تحليل كل من مجزأة وغير مجزأة كرنا من كل عينة. فمن الأفضل لتحميل عينات (مجزأة وغير مجزأة) في الممرات المجاورة. تسجيل هوية كل عينة في كل حارة.</li><li> إضافة 4 ميكروليتر من سلم ال DNA (BioLine سلم سهل لي حجم قياسي أو علامة Novagen PCR) لمسار واحد من هلام</li><li> تشغيل الجل لمدة 20 دقيقة.</li><li> تخيل E – الجل على transilluminator. التقاط صورة هلام.</li></ol><p class="jove_title"> 10. التهجين إلى 2.0 الخميرة GeneChip</p><p class="jove_step"نتائج الممثل> :</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong> الشكل 1.</strong> A الخميرة Affymetrix GeneChip صورة الممسوحة ضوئيا (Affymetrix برامج التشغيل GeneChip (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong> Figure2.</strong> مؤامرة مبعثر 2D جميع النصوص الوراثية (الجينات ~ 6700) ، ومقارنة البيانات وعنصر تحكم الخميرة المعالجة. كل نقطة تمثل جين واحد. جينات اللون البنفسجي في إشارة الجينات التي يتم التعبير عن الجينات بشكل مختلف في حين الملونة باللون الأحمر ليست كذلك. وصفت أوصاف للجينات وأعرب تفاضلي في المقابل أسطورة وتشارك أكثر في السيطرة دورة الخلية في هذا المثال. (برامج التشغيل GeneChip Affymetrix (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="Figure 3" /<br /><strong> الشكل 3.</strong> هذا يوضح المخطط الانسيابي الجينات بشكل مختلف عنها في مسار بيولوجي المتضررة. الجينات وأشار بنجمة حمراء تدل على جينات أسفل التنظيم في المسار الانتصافي. (قاعدة بيانات عن الشرح ، والتصور المتكامل ديسكفري (ديفيد)</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="Figure 4" /<br /><strong> الشكل 4.</strong> النتائج ممثل مؤامرة بركان. وتمت مقارنة عينات الرقابة والمعالجة بقيمة – P قطع من 0.05 وتغيير التعبير 1،5 أضعاف اقتطاع. ولدت هذه المؤامرة لاستخدام البرمجيات Geospiza Genesifter تبرعت تتكرم للطلاب لأغراض تعليمية.</p>
Discussion
<p class="jove_step"<التطبيقات وأهميتها.</p><p class="jove_content"> الوراثة وفيرمونت برنامج التوعية الشبكة ، في جامعة فيرمونت ، وتجري الجامعية الوصول إلى ثماني كليات البكالوريا شريك في جميع أنحاء الدولة. هدف VGN التوعية الأساسية هو فضح الطلاب الجامعيين في ولاية فيرمونت لدولة من بين أحدث التقنيات العلمية والموارد باستخدام التدريب العملي على الخبرات. وكان وحدة صفها ميكروأري المتقدمة في عام 2003 ورفع مستواها في وقت لاحق. وقد عرضت على أنها بالطبع مصغرة أو دمجها في المناهج الدراسية المختبرات الموجودة في المؤسسات المشاركة.</p><p class="jove_content"> هذا المشروع ، بين النوى البحوث الجامعية والكليات الجامعية ، ويعزز التعاون في مجال التعليم والبحوث. وقد عزز ميكروأري التوعية في جميع أنحاء الدولة المناهج والبحوث وخلقت فرص التواصل للمرافق الأساسية ، وأعضاء هيئة التدريس والطلاب.</p><p class="jove_content"> أعضاء هيئة التدريس الجامعية واعتماد برنامج وتشجيعهم على تصميم تجارب فريدة من نوعها بشرط أن تكون هناك مناسبة GeneChips Affymetrix وشرح المتاحة. جميع المعلومات عن هذه الوحدة بما في ذلك دليل المختبرات والمراجع والعروض التقديمية على شبكة الإنترنت (فيرمونت شبكة علم الوراثة ، 2008).</p><p class="jove_step"> خطوات هامة :</p><p class="jove_content"<em> Spheroplasting :</em> ومن المهم أن نلاحظ spheroplasting ناجحة تحت المجهر. استخدام SDS مفيد للغاية لأنها تسبب تورم الخميرة مما أدى إلى الأجسام الشبه الكروية. ومن المهم أن نلاحظ أن الخلايا التكاثرية شكل الأجسام الشبه الكروية كذلك. إذا لوحظ spheroplasting الجزئية ، فمن المستحسن علاج موسع مع lyticase.</p><p class="jove_content"<em> بيليه التنظيف :</em> هطول الأمطار خلال رد فعل خطوة لاحقة وغسل الإيثانول ، فمن السهل جدا أن نخسر بيليه [كدنا]. العناية القصوى والاهتمام الدقيق لبيليه أمر حتمي.</p><p class="jove_content"<em> طلب الماء الى وسط الغشاء :</em> خلال الخطوة شطف الحمض النووي الريبي من الغشاء ، فمن المهم "بخ" في 30 ميكرولتر من المياه مباشرة الى مركز للغشاء السيليكا. إذا لم يتم تحقيق ذلك ، يمكن طرد العمود ويمكن أن تكون نتيجة إعادة elutant تطبق على غشاء السيليكا مرة أخرى. ويمكن تكرار هذا الأمر عدة مرات حسب الضرورة.</p><p class="jove_step"> تعديلات وتبديلات المنتج :</p><ol><liيمكن أن تكون بديلا> بديل RNA تنظيف أعمدة. الأمثلة على ذلك ، USB الإعدادية سهولة وصله الصرفة Invitrogen طقم الجيش الملكي النيبالي ، والحمض النووي الريبي أوميغا تنظيف عدة على سبيل المثال لا الحصر.</li><li> Schizosaccharomyces pombe هو الخميرة اختيارية. وGeneChip Affymetrix يحتوي على كل الجينوم على الشريحة نفسها</li><liويمكن استخدام> العلاجات المختلفة والأوقات. وهذا قد يشمل العلاج بالعقاقير ، والعلاج في درجة الحرارة ، ومكافحة للتأكسد ، ويمكن أيضا معالجة مرات الخ تعديلها.</li><liقد لا> الدناز العلاج تكون هناك حاجة لأن الأساليب المذكورة توظف لاستخدام التمهيدي (DT) أليغو.</li><li> ليس المطلوب لتنفيذ شطف مزدوجة من الحمض النووي الريبي قبالة العمود مع نفس قسامة 30 ميكرولتر. مرة واحدة دائما تقريبا كافية. ويقترح هذا لضمان أن يتم الحصول على الشفاء الكامل. بالإضافة إلى ذلك ، المياه المستخدمة لأزل الحمض النووي الريبي من العمود يمكن قبل تسخينها إلى 65 درجة مئوية لتعزيز القدرة على استرداد رنا من العمود السيليكا.</li><li> طرق كثيرة متاحة لتحديد الحمض النووي الريبي. لا تملك إلا وكان إيبندورف Nanodrop المختارة لسهولة استخدامها واختبار دقة.</li><li> هلام إستشراد Agarose كثير يتعين القيام بها باستخدام معيار المعدات المختبرية. غير مطلوب E – جل أمر مرغوب فيه ولكن لأنها حرة وريبونوكلياز لا يتطلب ترسيخ هلام وقت الانتظار.</li><liوقد تم تزويد> معلومات الطلب على المنتجات. ومع ذلك ، يمكن أن يؤمر الكواشف العام العديد من بائعين متعددين.</li><liويمكن شراء> الكواشف دورة واحدة على حدة [كدنا] إذا كان هذا هو أكثر فعالية من حيث التكلفة.</li><li> هناك طرق أخرى الإعدادية الهدف لكننا نرى هذا واحد يقدم المزيد من فرص التعليم للطالب.</li></ol>
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> جامعة فيرمونت ، فيرمونت الوراثة الشبكة. تم نشر هذا ممكن عن طريق شبكة الوراثة فيرمونت ، من خلال عدد المنح P20 RR16462 من برنامج المنح برين وعدد P20 RR16462 من برنامج INBRE theNational مركز لبحوث الموارد (NCRR) ، وهو مكون من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) . محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للNCRR أو المعاهد الوطنية للصحة.</p><p class="jove_content"> ونود أن نشكر جميع المؤسسات المشاركة لدينا التوعية لتعاونها ومساهمتها في وحدة تكرير هذا كاسلتون الدولة الكلية ، كلية جبل الأخضر ، كلية جونسون الدولة ، والدولة ليندون الكلية ، كلية مارلبورو ، كلية ميدلبري ، جامعة وكلية نورويتش سانت مايكل.</p>
Materials
| General Laboratory Equipment | Company | Product number |
| Spetrophotometer | ||
| Thermocyler | ||
| Microcentrifuge | ||
| Vortex | ||
| Stir Plates (2) | ||
| P-10s pipettors | ||
| P-20’s pipettors: | ||
| P-200’s pipettors: | ||
| P-1000’s pipettors: | ||
| Camera and transilluminator | ||
| Supplies – recommended | ||
| E-Gel Apparatus | Invitrogen | G6000-08 |
| E-Gels | Invitrogen | G6018-02 |
| Axygen 1.7 ml. Clear | Krackler | 383-MCT175C |
| Axygen 0.5 ml clear tubes | Krackler | 383-MCT060C |
| Axygen 2ml capture tubes | Krackler | 383-MCT200NC |
| boxes of P-10 ART tips: | CLP | BT10XL |
| Boxes of P-100 ART tips: | CLP | BT200 |
| Boxes of P-20 ART Tips: | CLP | BT20 |
| Boxes of P-1000 ART Tips: | CLP | BT1000 |
| Yeast Chips | ||
| General Laboratory Supplies | ||
| 25 ml sterile disposable pipets- | ||
| 5ml sterile disposable pipets- | ||
| Microfuge tube racks | ||
| KimWipes: | ||
| Lab Coats | ||
| Stir Bars | ||
| Culture flasks | ||
| Innoculating loops | ||
| Sharpies | ||
| Gloves | ||
| Autoclave tape | ||
| Stirrer bars | ||
| Reagents | ||
| 30% Hydrogen Peroxide | EMD Millipore | 386790 |
| HBSS without Ca, Mg, or dye | Sigma-Aldrich | H6648-100ml |
| Qiagen Rneasy Mini Kit: | Qiagen | 74104 |
| Qiagen DNase Kit: | Qiagen | 79254 |
| Rnase Remover | Denville Scientific | D1180 |
| Harleco Alcohol 100% | EMD Millipore | 65347 |
| ENZO IVT Kit | ENZO | ENZ-42655-10 |
| Lyticase: one bottle | VWR | IC19012310 |
| Water, Cell Culture grade | EMD Millipore | 4.86505 |
| Yeast culture: | ATCC | 18824 |
| YPD broth powder | EMD Millipore | 4.8504 |
| D(+) Glucose, Anhydrous | EMD Millipore | 346351 |
| Sorbitol | EMD Millipore | 56755 |
| EDTA | EMD Millipore | 4005 |
| SDS solution, 20% | EMD Millipore | 7990-OP |
| Pellet Paint | EMD Millipore | 69049 |
| PCI RNase DNase free (7 aliquots): | Fisher | AC32711-500 |
| 7.5M NH4OAc | Fisher | ICN1987 5980 |
| Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA) | ||
| Trizma Base | Fiaher | 50-899-90034 |
| KOAc | Fisher | NC9757725 |
| MgOA | Fisher | NC9681042 |
| Loading Dye | Invitrogen | 10482055 |
| PCR Markers | EMD Millipore | 69278-3 |
| Phase Lock Gels | Fisher | FP2302820 |
| One-Cycle cDNA Kit | Invitrogen | A10752-030 |
| Includes; | ||
| E. coli DNA Pol | ||
| dNTP’s | ||
| T4 DNA Pol. | ||
| T-7 oligod(T) | ||
| 0.5ml EDTA pH 8.0 | ||
| First Strand Buffer | ||
| E. Coli RNaseH | ||
| Second Strand Buffer | ||
| E. Coli DNA ligase | ||
| SuperScript II | ||
| DTT | ||
References
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).
- D’Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
- Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis. J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).
- Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).
- Vermont Genetics Network. . Microarray Outreach. , (2008).
- . . Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual. , (2004).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Dennis, G., Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).
Cite This Article
Tighe, S., Hunter, T., Reed, P., Murray, J. Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (50), e2585, doi:10.3791/2585 (2011).