Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

Summary

Neste protocolo a expressão do gene, em leveduras (<em> Saccharomyces cerevisiae</em>) É alterada após a exposição ao estresse oxidativo induzido pela adição de peróxido de hidrogênio (H₂ O₂), Um agente oxidante.

Abstract

Neste protocolo, a expressão gênica em leveduras (Saccharomyces cerevisiae) é alterada após a exposição ao estresse oxidativo induzido pela adição de peróxido de hidrogênio (H ₂ O _2), um agente oxidante. No experimento, o fermento é cultivado por 48 horas em caldo YPD 1/2X contendo glicose 3X. A cultura é dividido em um controle e grupo tratado. A cultura experimento é tratada com 0,5 mM H ₂ O ₂ em Buffered Saline Hanks (HBSS) por 1 hora. A cultura de controle é tratado com HBSS só. Total de RNA é extraído de ambas as culturas e é convertido em um produto marcado com biotina cRNA através de um processo de várias etapas. O produto final é a síntese levado de volta para o Mecanismo de Núcleo UVM Microarray e hibridizada com o fermento GeneChips Affymetrix. Os dados expressão resultante gene são enviados para bioinformática software de análise de dados.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Isolar RNA total de<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Usando Lise enzimática</p><ol><li> Prepare uma zona de trabalho RNase-free usando RNase ZAP (Ambion).</li><li> Prepare lyticase reagente de trabalho de fresco, adicionando 1 ml de RNase água diretamente para o frasco lyticase para fazer uma solução final de trabalho de 10 U / ul. Vortex bem e inverter várias vezes para garantir a mistura completa. Esta 10 unidades / mL solução é estável por 12 horas.</li><li> Prepare fresco DNase solução que eu usando o kit Qiagen DNase e armazenar no gelo.</li><li> Rótulo um tubo de microcentrífuga 1,7 ml com as suas informações de identificação. Transferência de 1,5 ml da cultura de levedura apropriadas para dentro do tubo.</li><li> Centrifugue o tubo a 5000 xg (cerca de velocidade 04/03 completa) por 2 minutos em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante (sem pellet preocupante), usando uma micropipeta e desprezar o sobrenadante.<strong>**** Repita o passo 4 se o tamanho da pelota é muito pequeno ou se indicado pelo instrutor .****</strong</li><li> Adicionar 1000 mL de água DEPC para o pellet, vortex, e centrifugar a 5000 xg por 2 minutos. Desprezar o sobrenadante. Remover o máximo de líquido possível do pellet levedura.</li><li> Adicione o seguinte para o fermento da pelota e vortex para misturar.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> SGbuffer</td><td> 10 mL</td></tr><tr><td> Lyticasesolution (10u/μl)</td><td> 30 mL</td></tr></tbody></table</li><li> Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.</li><li> Agite suavemente o tubo a cada 10 minutos para gerar esferoplastos. Esferoplastos devem ser manuseados com cuidado. Examine levedura sob o microscópio para observar spheroplasting completa. Ao examinar o fermento na lâmina de microscópio, adicionar uma pequena quantidade de 0,1% SDS para causar o fermento a crescer e formar esferas perfeitas (mesmo para as células de brotamento). Isto indica que as paredes celulares têm sido digerida.</li><li> Adicionar 350 b-tampão RLT mL para o tubo e vortex<strong> Vigorosamente</strong> Por 1 minuto. Garantir o seu tubo é bem fechados, segurando a tampa fechada enquanto vórtex. Este procedimento irá lisar as esferoplastos.</li><li> Adicionar 250 mL de etanol 100% para o tubo e vortex por alguns instantes. Um precipitado pode formar após a adição de etanol, mas isso não afetará a cobrança de RNA.</li><li<strong> Coleta de RNA:</strongLabel> uma coluna de spin RNeasy com sua identificação informationand transferir cuidadosamente toda a solução do passo 10 para a coluna de spin usando uma micropipeta. Tenha cuidado para não tocar a membrana de sílica com a ponta da pipeta. Fechar o tubo e centrifugar por 15 segundos em velocidade máxima. O RNA na amostra irá aderir à membrana de sílica da coluna spin.</li><li> Remove a coluna girar do tubo de coleta. Pipeta passar o meio líquido (o líquido no tubo de coleta) de volta para a coluna de spin e centrifugar novamente. Descartar o tubo de coleta (com o fluxo através de líquidos) e colocar a coluna de spin em um novo tubo de recolha de 2 ml.</li><li> Adicionar 350 mL de buffer RW1 à coluna spin. Esta solução é usada para lavar o RNA e remover sais e resíduos celulares dissolvido. Fechar o tubo e centrifugar por 15 segundos em velocidade máxima.</li><li<strong> A digestão do DNA:</strong> Remove a coluna de spin da centrífuga, abra a tampa do tubo, e adicionar 80 mL de solução de DNase I para o meio da membrana coluna spin. Esta etapa irá digerir qualquer gDNA na amostra. Feche a tampa da coluna e incubar a temperatura ambiente por 15 minutos.</li><li> Transferir a coluna de giro para um novo tubo de recolha de 2 ml.</li><li<strong> Limpeza e lavagem do RNA:</strong> Adicionar 350 mL de buffer RW1 para a coluna de spin e centrifugar a toda a velocidade por 15 segundos.</li><li> Descartar o tubo coletor e colocar a coluna de spin em um novo tubo de recolha de 2 ml.</li><li> Adicionar 500 mL de buffer RPE para a coluna de giro para lavar o RNA na membrana de sílica. Fechar o tubo e centrifugar por 15 segundos em velocidade máxima<em>.</em</li><li> Descartar o tubo coletor e colocar a coluna de spin em um novo tubo de recolha de 2 ml.</li><li> Lave a membrana de sílica novamente, adicionando mais 500 mL tampão RPE para a coluna de spin. Fechar o tubo e centrifugar por 15 segundos em velocidade máxima.</li><li> Coloque a coluna girar em um novo tubo de recolha de 2 ml e centrifugar em microcentrífuga à velocidade máxima durante 1 minuto para assegurar qualquer líquido residual é removido da membrana de sílica.</li><li<strong> Recuperar o RNA:</strong> Transferir a coluna girar RNeasy para um novo tubo de microcentrífuga 1,7 ml que foi identificada apenas com as informações da amostra. Note que a tampa do tubo novo será deixada em aberto para os próximos passos.</li><li> Cuidadosamente pipeta 30 mL de água livre de RNase<strong> Diretamente para o centro</strong> Da membrana de sílica.<strong> Não toque na membrana de sílica com a ponta da pipeta (veja o diagrama)</strong>. Olhar de perto como de executar este passo. Use ambas as mãos para guiar a pipeta. Certifique-se que a água está distribuída uniformemente na membrana.</li><li> Incubar a coluna de spin em temperatura ambiente por 1 minuto. Centrifugar à velocidade máxima por 30 segundos.</li><li> Cuidadosamente transferir a 30 mL, que é recuperado no tubo de 1,7 ml de volta para o centro da membrana de sílica da coluna de mesmo spin como na etapa 22 acima. Coloque a coluna de volta no mesmo tubo de recolha de 1,7 ml e incubar por 1 minuto à temperatura ambiente. Centrifugar por 1 minuto em velocidade máxima. Esta eluição dupla garante que a quantidade máxima de RNA é recuperado a partir da membrana.</li><liLabel> dois novos tubos de 1,7 ml de microcentrífuga com suas informações de identificação e transferência de todas as amostras de RNA recuperado para um desses tubos.</li><li> Transferência de 4 mL da amostra para outro tubo rotulado. Esta amostra será transportado de volta para UVM para a quantificação e avaliação Nanodrop RNA qualitativo (Isto é para validar RNA análise quantitativa e qualitativa realizada no local, participando instituto).</li><li> Coloque todas as amostras no gelo.</li><li<strong> Quantificação do RNA:</strong> Usando o Biophotometer Eppendorf, medir a absorvância da amostra de RNA no espectrofotômetro a uma diluição de 1 para 50 (1μl de amostra + 49μl H₂ O).</li><li> Avaliar a qualidade RNA usando o E-Gel (Invitrogen) de 1,2% pré-moldado de gel de agarose para eletroforese.</li><li<strong> Análise Qualitativa RNA:</strong> Configure o aparelho de eletroforese em gel-E. Pré-executar o gel por 2 minutos de acordo com procedimento do fabricante. Após a pré-run, remova o pente gel e adicione 14 mL de água a cada poço seguido de 1μl de cada amostra em cada poço. Misture bem, pipetando cima e para baixo. Use uma escada de DNA de tamanho apropriado em um bem para a comparação do tamanho mais tarde (Escada Fácil BioLine Eu tamanho padrão ou Novagen PCR marcador). Registro que é amostra em cada pista. Executar o gel por 20 minutos.</li><li> Tire uma foto do gel.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Síntese Strand primeiro cDNA</p><ol><li> Rótulo de 0,5 ml do tubo PCR com suas informações de identificação. Da concentração de RNA determinada a partir da experiência acima, calcular o volume da amostra para obter 3,0 ug. Transferir este montante para o tubo. Adicione o suficiente RNase água para obter um volume de 11,0 ul.</li><li> Adicionar 1,0 mL T7 oligo (dT)₂₄ Reagente ao tubo. Certifique-se prestar especial atenção ao volume ponta da pipeta durante esta etapa para assegurar que todos os reagentes do foi transferido. Vortex do tubo e centrifugar a toda a velocidade por 5 segundos. Colocar o tubo em um termociclador fixada em 70 ° C por 10 minutos.</li><li> Enquanto a 70 ° C de incubação está em andamento, preparar o mix primeiro mestre vertente em um novo tubo. Certifique-se de adicionar os seguintes reagentes<strong> EM ORDEM,</strong> Vortex e centrifugar a toda a velocidade por 5 segundos e colocar o tubo no gelo.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Master mix Primeira vertente:</strong</td></tr><tr><td> FirstStrandBuffer5X</td><td> 4 mL</td></tr><tr><td> 0.1MDTT</td><td> 2 mL</td></tr><tr><td> 10mMdNTP</td><td> 1 mL</td></tr><tr><td> SuperscriptII</td><td> 1 mL</td></tr></tbody></table<br /> Use uma micropipeta P2 para medir volumes de 2 mL ou menos.</li><li> Após a 70 ° C de incubação no passo 2 é completo, adicionar 8 mL da mistura primeira vertente mestre fez na etapa 3 para o tubo e incubar em um termociclador a 42 ° C por 60 minutos. Quando a incubação primeira síntese vertente estiver concluída, coloque o tubo no gelo. Durante esta incubação, preparar o master mix segunda vertente.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Síntese Strand segunda cDNA</p><ol><li> Faça a mistura principal seguinte segunda vertente em um novo tubo. Mantê-lo no gelo. Vortex e centrifugar todos os reagentes antes de usar. Adicionar os reagentes na ordem listada.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Master mix segunda vertente</strong</td></tr><tr><td> Água DEPC</td><td> 91 ul</td></tr><tr><td> Tampão 5X Segundo Strand</td><td> 30 ul</td></tr><tr><td> DNTPs (10mM)</td><td> 3 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNA Ligase (10U/ul)</td><td> 1 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNA Polimerase I (10U/ul)</td><td> 4 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> RNase H (2U/ul)</td><td> 1 ul</td></tr></tbody></table</li><li> Vortex do tubo e centrifugar por 5 segundos em velocidade máxima.</li><li> Quando a 42 ° C de incubação é terminado, a transferência de todos os 130 mL da mistura segunda vertente mestre para o tubo de amostra contendo o RNA e reagentes primeira vertente. Vortex e centrifugar por 5 segundos em temperatura ambiente. Incubar o tubo por 2 horas a 16 ° C em um termociclador.</li><li> No final da incubação de 2 horas e enquanto a amostra ainda é a 16 º C, adicionar o reagente polimerase 2μl T4 DNA no tubo. Brevemente vortex e centrifugar o tubo e incubar a 16 ° C por não mais que cinco minutos adicionais. Incubar mais de 5 minutos pode reduzir a qualidade do cDNA, devido à atividade 5'exonuclease 3'to da polimerase T4.</li><li> No final da incubação 5 minutos, adicione 10 ml de EDTA 0,5 M para parar a reação de polimerase em T4 DNA. Armazenar o tubo a -20 ° C.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Precipitando o cDNA</p><ol><li> Centrífuga um tubo de Gel Fase de bloqueio a toda a velocidade por um minuto para segurar o gel está no fundo do tubo.<strong> NÃO TRAVA TUBOS VORTEX FASE</strong>.</li><li> Adicionar 162 mL da<strong> Camada inferior</strong> A partir do pH 8,0 Tris buffered fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (PCI) para o conteúdo do segundo tubo de reação strand cDNA síntese e vortex por 5 segundos para misturar o conteúdo (O volume total da etapa de síntese de cDNA a partir da experiência acima é 162 ul. O passo PCI exige volumes iguais de misturas aquosa e orgânica).</li><li> Transferir toda a mistura de cDNA-PCI para o tubo de gel fase de bloqueio usando uma micropipeta.<strong> NÃO VORTEX</strong> A fase de tubo de gel de bloqueio.</li><li> Centrifugar à velocidade máxima por 2 minutos.</li><li> Rótulo um novo tubo de microcentrífuga 1,7 ml. Use uma micropipeta para transferir a camada superior do tubo de gel fase de bloqueio para o tubo ml recém-rotulados 1.7. Tente recolher o máximo da camada possível.</li><li> Adicione o seguinte ao tubo de microcentrífuga de 1,7 ml e vortex.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> O etanol (100%)</td><td> 405 ul</td></tr><tr><td> NH₄ OAc</td><td> 80 ul</td></tr><tr><td> Pintura Pellet</td><td> 1 ul</td></tr></tbody></table</li><li> Coloque o tubo na centrífuga com a dobradiça do tubo virado para fora e centrifugar a toda a velocidade por 20 minutos em temperatura ambiente.</li><li> Remova cuidadosamente o tubo da centrífuga tomando cuidado para não perturbar o pellet cDNA. O pellet deve ser rosa e aproximadamente o tamanho de um grão de sal e no lado do tubo sob a dobradiça. Colocar no gelo e imediatamente vá para a etapa seguinte.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Limpeza do Pellet cDNA</p><ol><li> Usando uma micropipeta P1000, remova cuidadosamente todo o sobrenadante do tubo. Tenha cuidado para não perturbar o sedimento. Lembre-se que a pelota é o seu exemplo!</li><li> Adicionar 500μl de etanol 80% frio (armazenado em -20^° C freezer) para o tubo. Suavemente tampa do tubo e invertê-lo várias vezes, lentamente. Assista aos seus pellet muito de perto. Se o pellet se descolar, colocar o tubo de volta no rack e deixar o pellet para liquidar o fundo. Alternativamente, você pode centrifugar o tubo em alta velocidade por 15 segundos para obter a pelota de volta para o fundo do tubo.</li><li> Usando uma micropipeta P1000, cuidadosamente remover o etanol sendo muito cuidadoso para não perturbar o sedimento. Dica do tubo para permitir a remoção de líquidos como tanto quanto possível.</li><li> Repita os passos 2 e 3 com uma nova alíquota de etanol 80%.</li><li> Finalmente, remover todos os etanol possível usando uma micropipeta P1000. Centrifugar o tubo em alta velocidade por 5 segundos e usando uma micropipeta P20, remover o último poucos microlitros de etanol. O objetivo é remover o etanol tanto quanto possível, sem perturbar o sedimento.</li><li> Coloque o tubo aberto em um rack ou uma caixa de secagem por 10-20 minutos para evaporar o etanol remanescente. O pellet seco é facilmente perdida, uma vez que está seco. Becareful para lidar com o tubo delicadamente. Quando terminar, feche a tampa. Visualize o pellet seco para confirmar que está presente no tubo.</li><li> Ressuspender o sedimento em 22 mL de RNase água e colocar o tubo no gelo.</li></ol><p class="jove_title"> 6. InVitroTranscription (IVT)</p><ol><li> O ENZO bioarray kit contém todos os reagentes necessários para preparar cRNA rotulados biotina a partir de cDNA.<br /> Mixfor Um mestre toda a classe será preparado como instrutor follows.The irá preparar esta mistura ou designar alguém da classe. Isso deve ser feito em uma área livre de RNase.<br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Amt / amostra</td><td> # Amostras</td><td> Total</td></tr><tr><td> Reagente 1 [tampão de reação 10x]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagente 2 [Biotinnucleotides 10x]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagente 3 [TDT 10x]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagente 4 [Inibidor de RNase 10x]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagente 5 [20x T7 RNA polimerase]</td><td> 2μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volume Total</td><td> 18 mL</td><td></td><td></td></tr></tbody></table<br /><strong> NOTA:</strong> Prepare master mix suficiente para o número de amostras mais um. Isto irá assegurar suficiente para fins de pipetagem.</li><li> Rótulo de 0,5 ml do tubo PCR. Combine o seguinte no tubo e pipetar para cima e para baixo várias vezes para misturar. Girar em uma centrífuga a toda a velocidade por 5 segundos para obter todos os reagentes para o fundo do tubo.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> Mistura cDNA</td><td> 22μl</td></tr><tr><td> Enzomastermix [fromabove]</td><td> 18μl</td></tr><tr><td> TotalVolume</td><td> 40μl</td></tr></tbody></table</li><li> Incubar o tubo a 37 ° C for16 horas no termociclador. Quando a reação é completa, armazenar a amostra a -20 ° C</li></ol><p class="jove_title"> 7. A limpeza da cRNA biotinilado</p><ol><li> Transferir a amostra cRNA inteira para um novo tubo de microcentrífuga 1,7 ml. Adicionar 60 mL de água livre de RNase e 350 mL tampão RLT e vortex por 5 segundos.</li><li> Adicionar 250 mL de etanol 100% e vortex novamente.</li><li> Etiqueta uma coluna de spin RNeasy e transferir a amostra cRNA inteiro para a coluna. Tenha cuidado para não tocar a ponta da pipeta para a membrana de sílica. Feche a tampa e centrifugar por 15 segundos em velocidade máxima.</li><li> Remove a coluna girar do tubo de coleta. Pipeta passar o meio líquido (o líquido no tubo de coleta) de volta para a coluna de spin e centrifugar novamente por 15 segundos.</li><li> Coloque a coluna girar em um novo tubo de recolha de 2 ml e Pipete 500 de tampão RPE na coluna spin. Fechar o tubo e centrifugar por 15 segundos em velocidade máxima. Tubo de coleta e descarte o repasse líquido. Coloque a coluna girar em um novo tubo de recolha de 2 ml.</li><li> Adicionar mais 500 mL tampão RPE para a coluna de spin.</li><li> Transferir a coluna girar em um tubo de nova coleção e executar uma coluna de "secagem" spin em velocidade máxima por 2 minutos.</li><li> Rótulo um novo tubo de microcentrífuga 1,7 ml com as suas informações de identificação. Transferência da coluna de giro para este tubo.</li><li> Pipetar 30 água RNase mL para a membrana de sílica centro RNeasy e incubar à temperatura ambiente por 1 minuto. Fechar o tubo e centrifugar por 1 minuto em velocidade máxima.</li><li> Cuidadosamente transferir a 30 mL, que é recuperado no tubo de 1,7 ml de volta para o centro da membrana de sílica RNeasy da coluna de mesmo spin. Coloque a coluna volta para o mesmo tubo de recolha de 1,7 ml e incubar por 1 minuto à temperatura ambiente. Centrifugar por 1 minuto em velocidade máxima. Esta eluição dupla garante que a quantidade máxima de cRNA está recuperado da membrana.</li><li> Transfira esta cRNA biotina-rotulados limpa para um novo tubo de centrífuga de 1,7 ml e rotular adequadamente.</li><li> Determine a concentração cRNA usando o mesmo procedimento como descrito acima, durante o procedimento de isolamento do RNA. Registre a concentração e 260/280 ratio.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Fragmentando o cRNA para a Elaboração de destino</p><ol><li> Rótulo de 0,5 ml do tubo PCR com suas informações de identificação. Transferência de 5 ug do valor equivalente a cRNA ao tubo. Adicione o suficiente RNase água até que o volume total de 16,0 ul, e em seguida, adicione 4,0 mL de tampão 5X fragmentação ao tubo. O volume total no tubo deve ser 20,0 ul.</li><li> Vortex do tubo e centrifugar por 10 segundos. Incubar o tubo a 94 ° C por 30 minutos em um termociclador. Coloque no gelo após a incubação.</li></ol><p class="jove_title"> 9. Avaliar a cRNA fragmentados e não fragmentado usando Agarose Gel</p><ol><li> Configure o aparelho de eletroforese em gel-E usando um pré-moldado 1,2% gel agarose. Pré-executar o gel por 2 minutos de acordo com a recomendação do fabricante</li><li> Adicionar 14 mL de água a cada poço no E-gel.</li><li> Adicionar 2μl de cada amostra para cada poço e pipeta cima e para baixo para misturar bem. Analisar tanto o cRNA fragmentado e não fragmentado de cada amostra. É melhor para carregar as amostras (fragmentada e não fragmentado) em vias vizinhas. Registo da identidade de cada amostra em cada pista.</li><li> Adicione 4 mL de uma escada de ADN (BioLine Escada Fácil Eu tamanho padrão ou Novagen marcador PCR) para uma faixa do gel</li><li> Execute o gel por 20 minutos.</li><li> Visualize o E-gel em um transiluminador. Tire uma foto gel.</li></ol><p class="jove_title"> 10. Hibridação para a levedura 2,0 GeneChip</p><p class="jove_step"> Resultados Representante:</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong> Figura 1.</strong> A levedura digitalizados Affymetrix GeneChip Imagem (Affymetrix Software Operacional GeneChip (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong> Figura 2.</strong> Gráfico de dispersão 2D de todas as transcrições genéticas (genes ~ 6700), comparando um controle e dados de fermento tratado. Cada ponto representa um único gene. Genes coloridas em roxo indicam genes que são diferencialmente expressos, enquanto genes coloridos em vermelho não são. Descrições para os genes diferencialmente expressos são rotulados na legenda correspondente e mais estão envolvidos no controle do ciclo celular neste exemplo. (Affymetrix Operacional GeneChip Software (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="Figure 3" /<br /><strong> Figura 3.</strong> Este fluxograma ilustra diferencialmente genes expressos em uma via afetada biológica. Os genes indicados com uma estrela vermelha indicam os genes para baixo-regulado na via meiótica. (O banco de dados para anotação, visualização e Discovery Integrado (DAVID)</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="Figure 4" /<br /><strong> Figura 4.</strong> Resultados Representante de um Plot Volcano. Amostras de controle e tratado foram comparados com um valor-p corte de 0,05 e uma mudança de expressão de 1,5 vezes cortadas. Este lote foi gerada utilizando o software de Geospiza Genesifter gentilmente doados aos alunos para fins educacionais.</p>

Discussion

<p class="jove_step"> Aplicações e importância.</p><p class="jove_content"> O Vermont Genética Rede programa de extensão, na Universidade de Vermont, conduz à inclusão de graduação bacharelado oito faculdades parceiras em todo o estado. O objetivo do Núcleo VGN Outreach é expor alunos de graduação no estado de Vermont para o estado-da-arte da tecnologia científica e recursos utilizando experiências práticas. O módulo de microarray descrito foi desenvolvido em 2003 e posteriormente atualizado. Foi oferecido como um mini-curso ou integrado no currículo de laboratório existentes nas instituições participantes.</p><p class="jove_content"> Este projecto, entre os núcleos de pesquisa universitários e faculdades de graduação, promove colaborações em educação e pesquisa. Microarray de expansão em todo o estado aumentou currículo e criado pesquisa e oportunidades de networking para as instalações do núcleo, professores e alunos.</p><p class="jove_content"> Como docente de graduação adotar o programa que eles são incentivados a elaborar experimentos único, desde há GeneChips apropriado Affymetrix e anotação disponíveis. Todas as informações para este módulo, incluindo o manual de laboratório, referências e apresentações PowerPoint estão disponíveis online (Vermont Genetics Network, 2008).</p><p class="jove_step"> As etapas críticas:</p><p class="jove_content"<em> Spheroplasting:</em> É importante observar spheroplasting bem sucedido sob o microscópio. O uso de SDS é altamente benéfica, pois faz com que o inchaço levedura resultando em esferóides. É importante observar que as células de brotamento forma esferóides também. Se spheroplasting parcial é observado, um tratamento prolongado com lyticase é recomendado.</p><p class="jove_content"<em> Limpeza Pellet:</em> Durante a reação de precipitação e lavagem posterior de etanol, é muito fácil perder o pellet cDNA. Extremo cuidado e atenção meticulosa ao pellet é um imperativo.</p><p class="jove_content"<em> Aplicando a água para o centro da membrana:</em> Durante a etapa de eluição RNA a partir da membrana, é importante para "injetar" o 30 de mL de água diretamente para o centro da membrana de sílica. Se isso não for realizado, a coluna pode ser centrifugado eo elutant resultante pode ser re-aplicada à membrana de sílica novamente. Isto pode ser repetido tantas vezes quanto necessário.</p><p class="jove_step"> Modificações e substituições de produto:</p><ol><li> Alternativa RNA clean-up colunas podem ser substituídos. Exemplos disso são o USB prep facilidade ea Invitrogen link Pure RNA kit, eo Omega RNA kit de limpeza para citar alguns.</li><li> Schizosaccharomyces pombe é uma levedura opcional. O GeneChip Affymetrix contém ambos os genomas no mesmo chip</li><li> Vários tratamentos e tempos podem ser usados. Isso pode incluir tratamentos com medicamentos, tratamentos de temperatura, anti-oxidantes, os tempos de tratamento, etc também podem ser ajustados.</li><li> DNase tratamento pode não ser necessário porque os métodos descritos empregar o uso de um primer Oligo (dT).</li><li> Não é necessário realizar uma eluição dobro do RNA fora da coluna com a alíquota de 30 mL mesma. Uma vez que quase sempre é adequada. Isto é sugerido para assegurar que uma recuperação completa é obtida. Além disso, a água usada para eluir o RNA a partir da coluna podem ser pré-aquecida a 65 ° C para aumentar ainda mais a capacidade de recuperar RNA a partir da coluna de sílica.</li><li> Muitos métodos estão disponíveis para quantificar RNA. A Eppendorf e Nanodrop só foram escolhidos devido a sua facilidade de uso e testado precisão.</li><li> Eletroforese em gel de Agarose muitos ser realizada utilizando equipamento de laboratório padrão. O E-Gel não é necessário, mas é desejável porque é RNase livre e não requer a solidificação do gel tempo de espera.</li><li> Informações sobre pedidos de produtos tem sido fornecido. No entanto, muitos reagentes geral pode ser encomendado a partir de vários fornecedores.</li><li> Uma reagentes Ciclo cDNA podem ser adquiridos separadamente se que é mais rentável.</li><li> Existem métodos de preparação se destina, mas nós sentimos este oferece mais oportunidades de ensino para o aluno.</li></ol>

Materials

General Laboratory Equipment	Company	Product number
Spetrophotometer
Thermocyler
Microcentrifuge
Vortex
Stir Plates (2)
P-10s pipettors
P-20’s pipettors:
P-200’s pipettors:
P-1000’s pipettors:
Camera and transilluminator
Supplies – recommended
E-Gel Apparatus	Invitrogen	G6000-08
E-Gels	Invitrogen	G6018-02
Axygen 1.7 ml. Clear	Krackler	383-MCT175C
Axygen 0.5 ml clear tubes	Krackler	383-MCT060C
Axygen 2ml capture tubes	Krackler	383-MCT200NC
boxes of P-10 ART tips:	CLP	BT10XL
Boxes of P-100 ART tips:	CLP	BT200
Boxes of P-20 ART Tips:	CLP	BT20
Boxes of P-1000 ART Tips:	CLP	BT1000
Yeast Chips
General Laboratory Supplies
25 ml sterile disposable pipets-
5ml sterile disposable pipets-
Microfuge tube racks
KimWipes:
Lab Coats
Stir Bars
Culture flasks
Innoculating loops
Sharpies
Gloves
Autoclave tape
Stirrer bars
Reagents
30% Hydrogen Peroxide	EMD Millipore	386790
HBSS without Ca, Mg, or dye	Sigma-Aldrich	H6648-100ml
Qiagen Rneasy Mini Kit:	Qiagen	74104
Qiagen DNase Kit:	Qiagen	79254
Rnase Remover	Denville Scientific	D1180
Harleco Alcohol 100%	EMD Millipore	65347
ENZO IVT Kit	ENZO	ENZ-42655-10
Lyticase: one bottle	VWR	IC19012310
Water, Cell Culture grade	EMD Millipore	4.86505
Yeast culture:	ATCC	18824
YPD broth powder	EMD Millipore	4.8504
D(+) Glucose, Anhydrous	EMD Millipore	346351
Sorbitol	EMD Millipore	56755
EDTA	EMD Millipore	4005
SDS solution, 20%	EMD Millipore	7990-OP
Pellet Paint	EMD Millipore	69049
PCI RNase DNase free (7 aliquots):	Fisher	AC32711-500
7.5M NH4OAc	Fisher	ICN1987 5980
Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)
Trizma Base	Fiaher	50-899-90034
KOAc	Fisher	NC9757725
MgOA	Fisher	NC9681042
Loading Dye	Invitrogen	10482055
PCR Markers	EMD Millipore	69278-3
Phase Lock Gels	Fisher	FP2302820
One-Cycle cDNA Kit	Invitrogen	A10752-030
Includes;
E. coli DNA Pol
dNTP’s
T4 DNA Pol.
T-7 oligod(T)
0.5ml EDTA pH 8.0
First Strand Buffer
E. Coli RNaseH
Second Strand Buffer
E. Coli DNA ligase
SuperScript II
DTT