<p class="jove_title"> 1. Isoleren van Totaal RNA uit<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Met behulp van Enzymatische Lysis</p><ol><li> Bereid een RNase-vrije werkzone met behulp van RNase ZAP (Ambion).</li><li> Bereid te werken lyticase reagens door het toevoegen van 1 ml RNase-vrij water direct naar de lyticase flacon om een definitieve werkende oplossing van 10 U / ul te maken. Vortex goed en keer een paar keer om volledige menging te verzekeren. Deze 10 eenheden / ul-oplossing is stabiel gedurende 12 uur.</li><li> Bereid verse DNase I-oplossing met behulp van de Qiagen DNase kit en op te slaan op het ijs.</li><li> Label een 1,7 ml microcentrifugebuis met uw identificatie informatie. Overdracht 1,5 ml van de juiste gist cultuur in de buis.</li><li> Centrifugeer de buis bij 5000 xg (ongeveer 3 / 4 vol snelheid) gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het supernatans (zonder te verstoren pellet) met behulp van een micropipet Verwijder de bovenstaande vloeistof.<strong>**** Herhaal stap 4 indien korrelgrootte te klein is of indien aangegeven door instructeur .****</strong</li><li> Voeg ui 1000 DEPC water om de korrel, vortex, en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 2 minuten. Giet het supernatans af. Verwijder zoveel mogelijk van de vloeistof als mogelijk van de gist pellet.</li><li> Voeg de volgende aan de gist pellet en vortex te mengen.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> SGbuffer</td><td> 10 pi</td></tr><tr><td> Lyticasesolution (10u/μl)</td><td> 30 pl</td></tr></tbody></table</li><li> Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li><li> Zwenk de buis elke 10 minuten naar spheroplasts te genereren. Spheroplasts moet voorzichtig worden omgegaan. Onderzoek gist onder de microscoop te voltooien spheroplasting observeren. Terwijl onderzoek van de gist op de microscoopglaasje, voeg een kleine hoeveelheid van 0,1% SDS op de gist veroorzaakt te zwellen en vormen een perfecte bollen (zelfs voor beginnende cellen). Dit geeft aan dat de celwanden zijn verteerd.</li><li> Voeg 350 ul b-RLT buffer aan de buis en vortex<strong> Krachtig</strong> Voor 1 minuut. Zorg ervoor dat uw buis wordt goed afgesloten door houden van de deksel gesloten, terwijl vortexen. Deze procedure zal lyseren de spheroplasts.</li><li> Voeg 250 ul 100% ethanol aan de buis en kort vortex. Een neerslag kan ontstaan na de toevoeging van ethanol, maar dit heeft geen invloed op de collectie van RNA.</li><li<strong> Het verzamelen van de RNA:</strong> Label een RNeasy draaien kolom met uw identificatie informationand zorgvuldig overdracht van al de oplossing van stap 10 naar de spin kolom met behulp van een micropipet. Wees voorzichtig dat u de silica membraan contact met de pipet tip. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid. Het RNA in de steekproef zal houden aan de silica membraan van de spin kolom.</li><li> Verwijder de spin kolom uit de collectie buis. Pipet de pas door de vloeistof (de vloeistof in de collectie tube) terug op de spin kolom en centrifuge opnieuw. Gooi de collectie buis (met de stroom door de vloeistof) en plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis.</li><li> Voeg 350 ul RW1 buffer om de spin kolom. Deze oplossing wordt gebruikt om de RNA-wassen en zouten en opgeloste cellulaire puin te verwijderen. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid.</li><li<strong> Het verteren van het DNA:</strong> Verwijder de spin kolom uit de centrifuge, opent de buis deksel en voeg 80 ul van DNase I oplossing voor het midden van de spin kolom membraan. Deze stap zal verteren elke gDNA in het monster. Sluit het deksel kolom en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li><li> Transfer de spin kolom naar een nieuwe 2 ml collectie buis.</li><li<strong> Reinigen en wassen van de RNA:</strong> Voeg 350 ul RW1 buffer om de spin kolom en centrifugeer op volle snelheid gedurende 15 seconden.</li><li> Gooi de collectie buis en plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis.</li><li> Voeg 500 ul RPE buffer om de spin kolom om de RNA op het silica membraan te wassen. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid<em>.</em</li><li> Gooi de collectie buis en plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis.</li><li> Nogmaals Was de silica membraan door het toevoegen van een andere 500 ul RPE buffer om de spin kolom. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid.</li><li> Plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis en centrifugeer in een microcentrifuge op volle snelheid gedurende 1 minuut om ervoor te zorgen eventueel resterende vloeistof is verwijderd uit het silica membraan.</li><li<strong> Herstel van de RNA:</strong> Breng de RNeasy draaien kolom naar een nieuwe 1,7 ml microcentrifugebuis dat is gelabeld met uw monster informatie. Merk op dat de dop van de nieuwe buis zal open zijn gelaten voor de volgende paar stappen.</li><li> Voorzichtig pipet 30 ul RNase-vrij water<strong> Direct op het centrum</strong> Van de silica membraan.<strong> Doe het silica membraan niet aanraken met de pipet tip (zie diagram)</strong>. Kijk goed als u deze stap uitvoert. Gebruik beide handen om de pipet gids. Zorg ervoor dat het water wordt gelijkmatig verdeeld over de membraan.</li><li> Incubeer de spin kolom bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Centrifugeer op volle snelheid gedurende 30 seconden.</li><li> Voorzichtig overdracht van de 30 ul die wordt teruggewonnen terug in de 1,7 ml tube op het midden van het silica membraan van dezelfde spin kolom als in stap 22 hierboven. Plaats de kolom in dezelfde 1,7 ml verzamelbuis en incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 1 minuut op volle snelheid. Deze dubbele elutie verzekert dat de maximale hoeveelheid RNA wordt teruggewonnen uit het membraan.</li><li> Label twee nieuwe 1,7 ml microcentrifugebuizen met uw identificatie informatie en de overdracht van al de herstelde RNA monster tot een van deze buisjes.</li><li> Transfer 4 ui van dit monster naar de andere gemerkte buis. Dit monster zal terug worden vervoerd naar UVM voor Nanodrop kwantificering en RNA kwalitatieve beoordeling (Dit is om te valideren RNA kwantitatieve en kwalitatieve analyse uitgevoerd op locatie bij de deelnemende instelling).</li><li> Plaats alle monsters op het ijs.</li><li<strong> RNA Kwantificering:</strong> Met behulp van de Eppendorf Biophotometer, de absorptie van het RNA-monster te meten op de spectrofotometer bij een 1 tot 50 verdund (1μl monster + 49μl H<sub> 2</sub> O).</li><li> Evalueer de RNA-kwaliteit met behulp van de E-Gel (Invitrogen) 1,2% prefab agarosegel voor elektroforese.</li><li<strong> RNA Kwalitatieve Analyse:</strong> Stel de E-gelelektroforese apparaat. Pre-run de gel gedurende 2 minuten volgens de fabrikant procedure. Na de pre-run, verwijdert u de gel kam en voeg 14 ul van het water aan elk putje, gevolgd door 1μl van elk monster aan elk putje. Meng goed door en neer te pipetteren. Gebruik een passende omvang DNA Ladder in een goed voor maat vergelijking later (Bioline Gemakkelijk Ladder ik een standaardmaat of Novagen PCR marker). Record dat monster in elke baan. Laat de gel gedurende 20 minuten.</li><li> Maak een foto van de gel.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Eerste streng cDNA synthese</p><ol><li> Label een 0,5 ml PCR tube met uw identificatie informatie. Van de concentratie van RNA bepaald uit het bovenstaande experiment, berekent het volume van het monster op 3,0 ug te verkrijgen. Overdragen dit bedrag aan de buis. Voeg genoeg RNase-vrij water om het volume op 11,0 ul te brengen.</li><li> Voeg 1,0 ul T7 oligo (dT)<sub> 24</sub> Reagens op de buis. Zorg ervoor dat bijzondere aandacht te besteden aan de pipet tip volume tijdens deze stap om ervoor te zorgen dat al het reagens werd overgedragen. Vortex de buis en centrifugeer op volle snelheid gedurende 5 seconden. Plaats de buis in een thermocycler ingesteld op 70 ° C gedurende 10 minuten.</li><li> Terwijl de 70 ° C incubatie wordt uitgevoerd, de voorbereiding van de eerste streng master mix in een nieuwe buis. Zorg ervoor dat u de volgende reagentia toe te voegen<strong> OM,</strong> Vortex en centrifugeer op volle snelheid voor de vijf seconden en plaats de buis op het ijs.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Eerste deel master mix:</strong</td></tr><tr><td> FirstStrandBuffer5X</td><td> 4 pl</td></tr><tr><td> 0.1MDTT</td><td> 2 pi</td></tr><tr><td> 10mMdNTP</td><td> 1 pi</td></tr><tr><td> SuperscriptII</td><td> 1 pi</td></tr></tbody></table<br /> Gebruik een P2 micropipet om volumes van 2 pl of minder te meten.</li><li> Na de 70 ° C incubatie in stap 2 is voltooid, voeg 8 pi van de eerste streng master mix gemaakt in stap 3 aan de buis en incuberen in een thermocycler bij 42 ° C gedurende 60 minuten. Bij de eerste streng synthese van incubatie is voltooid, plaatst de buis op het ijs. Tijdens deze incubatie, de voorbereiding van de tweede streng master mix.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Tweede Strand cDNA synthese</p><ol><li> Maak de volgende tweede onderdeel master mix in een nieuwe buis. Hou het op het ijs. Vortex en centrifuge alle reagentia voor gebruik. Voeg de reagentia in de aangegeven volgorde.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Tweede deel master mix</strong</td></tr><tr><td> DEPC Water</td><td> 91 ul</td></tr><tr><td> 5X Tweede Strand Buffer</td><td> 30 ul</td></tr><tr><td> DNTPs (10mm)</td><td> 3 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNA-ligase (10U/ul)</td><td> Een ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNA Polymerase I (10U/ul)</td><td> 4 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> RNase H (2U/ul)</td><td> Een ul</td></tr></tbody></table</li><li> Vortex de buis en centrifugeer gedurende 5 seconden op volle snelheid.</li><li> Wanneer de 42 ° C incubatie is voltooid, overdracht alle 130 ul van de tweede streng master mix op de monsterbuis met het RNA en de eerste streng reagentia. Vortex en centrifugeer gedurende 5 seconden bij kamertemperatuur. Incubeer de buis gedurende 2 uur bij 16 ° C in een thermocycler.</li><li> Op het einde van de 2 uur incubatie en terwijl het monster is nog steeds op 16 ° C, 2μl T4 DNA-polymerase reagens toe te voegen aan de buis. Kort vortex en de buis en incubeer bij 16 ° C centrifuge voor niet meer dan 5 extra minuten. Incuberen langer dan 5 minuten kan de kwaliteit van de cDNA als gevolg van de 3'to 5'exonuclease activiteit van de T4-polymerase.</li><li> Aan het eind van de 5 minuten incubatie, voeg 10 ul 0,5 M EDTA aan de T4 DNA-polymerase reactie te stoppen. Bewaar de tube bij -20 ° C.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Precipiterend de cDNA</p><ol><li> Centrifuge een Phase Lock Gel tube op volle snelheid een minuut om te verzekeren de gel wordt op de bodem van de buis.<strong> NIET VORTEX FASE TUBES LOCK</strong>.</li><li> Voeg 162 ul van de<strong> Onderste laag</strong> Uit de pH 8.0-Tris gebufferde Fenol / Chloroform / isoamylalcohol (PCI), om de inhoud van de tweede streng cDNA-synthese reactie buis en vortex gedurende 5 seconden ingedrukt om de inhoud (De totale omvang van de cDNA-synthese stap uit het bovenstaande experiment mix is 162 ul. De PCI-stap vereist gelijke volumes van waterige en organische mengsels).</li><li> Breng alle van de cDNA-PCI-mengsel aan de fase slot gel buis met behulp van een micropipet.<strong> NIET VORTEX</strong> De fase slot gel buis.</li><li> Centrifugeer op volle snelheid gedurende 2 minuten.</li><li> Label een nieuwe 1,7 ml microcentrifugebuis. Gebruik een micropipet om de bovenste laag overgang van de fase sluis gel tube naar de nieuw label 1.7 ml buis. Probeer zoveel mogelijk van de laag als mogelijk te verzamelen.</li><li> Voeg de volgende om de 1,7 ml microcentrifugebuis en vortex.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> Ethanol (100%)</td><td> 405 ul</td></tr><tr><td> NH<sub> 4</sub> OAc</td><td> 80 ul</td></tr><tr><td> Pellet Paint</td><td> Een ul</td></tr></tbody></table</li><li> Plaats de buis in de centrifuge met het scharnier van de buis naar buiten gericht en centrifugeer op volle snelheid gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.</li><li> Verwijder de buis uit de centrifuge en let niet op de cDNA pellet te verstoren. De pellet moet roze en ongeveer de grootte van een korrel zout en aan de kant van de buis onder het scharnier. Plaats op ijs en onmiddellijk overgaan naar de volgende stap.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Reiniging van de cDNA Pellet</p><ol><li> Met behulp van een P1000 micropipet, verwijder zorgvuldig al het supernatant van de buis. Wees voorzichtig dat u de pellet te verstoren. Vergeet niet dat de pellet is je voorbeeld!</li><li> Voeg 500μl koude 80% ethanol (opgeslagen tot -20<sup> °</sup> C diepvriezer) op de buis. Voorzichtig dop de tube en omgekeerd het langzaam een paar keer. Let op je pellet op de voet. Als de pellet losraakt, terug te plaatsen van de buis in rek en laat de pellet op de bodem. Als alternatief kunt u de buis centrifuge op volle snelheid gedurende 15 seconden om de pellet terug naar de bodem van de buis.</li><li> Met behulp van een P1000 micropipet, verwijder voorzichtig de ethanol zeer voorzichtig om de pellet te verstoren. Tip de buis om de verwijdering van zoveel mogelijk vloeistof mogelijk te maken.</li><li> Herhaal stap 2 en 3 met een nieuwe portie van 80% ethanol.</li><li> Ten slotte verwijdert u al het ethanol mogelijk door middel van een P1000 micropipet. Centrifugeer de buis op volle snelheid voor 5 seconden en het gebruik van een P20 micropipet, verwijder dan de laatste paar microliter van ethanol. Het doel is om zoveel ethanol als mogelijk te verwijderen zonder de pellet te verstoren.</li><li> Plaats de open buis in een rek of drogen box voor 10-20 minuten om de resterende ethanol verdampen. De gedroogde pellet is gemakkelijk verloren zodra het droog is. WEES VOORZICHTIG om de buis voorzichtig te behandelen. Wanneer u klaar bent, sluit de dop. Visualiseer de gedroogde pellet om te bevestigen dat aanwezig is in de buis.</li><li> Resuspendeer de pellet in 22 ul van RNase-vrij water en plaats de buis op het ijs.</li></ol><p class="jove_title"> 6. InVitroTranscription (IVT)</p><ol><li> De ENZO bioarray kit bevat alle reagentia die nodig zijn om biotine gelabelde cRNA bereiden van cDNA.<br /> Een meester mixfor de hele klas wordt voorbereid als follows.The instructeur bereidt deze mix of wijst iemand uit de klas. Dit moet gebeuren in een RNase-vrij gebied.<br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Amt / monster</td><td> # Samples</td><td> Totaal</td></tr><tr><td> Reagens 1 [10x Reactie buffer]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagens 2 [10x Biotinnucleotides]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagens 3 [10x DTT]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagens 4 [10x RNase Inhibitor]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagens 5 [20x T7 RNA-polymerase]</td><td> 2μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Totaal Volume</td><td> 18 ul</td><td></td><td></td></tr></tbody></table<br /><strong> LET OP:</strong> Bereid voldoende master mix voor het aantal monsters plus een. Dit zal voldoende te verzekeren voor pipetteren doeleinden.</li><li> Label een 0,5 ml PCR-buis. Combineer het volgende in de buis en pipet op en neer meerdere malen om te mengen. Spin in een centrifuge op volle snelheid gedurende 5 seconden ingedrukt om alle reagentia tot op de bodem van de buis.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> CDNA mengsel</td><td> 22μl</td></tr><tr><td> Enzomastermix [fromabove]</td><td> 18μl</td></tr><tr><td> TotalVolume</td><td> 40μl</td></tr></tbody></table</li><li> Incubeer de buis bij 37 ° C for16 uur in de thermocycler. Wanneer de reactie is voltooid, bewaren van het monster bij -20 ° C</li></ol><p class="jove_title"> 7. Reiniging van de Gebiotinyleerd cRNA</p><ol><li> Breng de hele cRNA monster op een nieuw 1,7 ml microcentrifugebuis. Voeg 60 ul van RNase-vrij water en 350 ul RLT buffer en vortex gedurende 5 seconden.</li><li> Nogmaals Voeg 250 ul 100% ethanol en vortex.</li><li> Label een RNeasy spin-kolom en breng de hele cRNA monster op de kolom. Pas op dat u het uiteinde van de pipet touch aan het silica membraan. Sluit het deksel en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid.</li><li> Verwijder de spin kolom uit de collectie buis. Pipet de pas door de vloeistof (de vloeistof in de collectie tube) terug op de spin kolom en centrifugeer opnieuw gedurende 15 seconden.</li><li> Plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis en pipet 500 pi van RPE buffer op de spin kolom. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid. Gooi collectie buis en de pas door de vloeistof. Plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis.</li><li> Voeg nog eens 500 ul RPE buffer om de spin kolom.</li><li> Transfer de spin kolom in een nieuwe collectie buis en het uitvoeren van een kolom "drogen" draaien op volle snelheid gedurende 2 minuten.</li><li> Label een nieuwe 1,7 ml microcentrifugebuis met uw identificatie informatie. Overdracht van de spin kolom van deze buis.</li><li> Pipetteer 30 ul RNase-vrij water op het midden RNeasy silica membraan en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 1 minuut op volle snelheid.</li><li> Voorzichtig overdracht van de 30 ul die wordt teruggewonnen terug in de 1,7 ml tube op het midden van de RNeasy silica membraan van dezelfde spin kolom. Plaats de kolom in om dezelfde 1,7 ml verzamelbuis en incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 1 minuut op volle snelheid. Deze dubbele elutie verzekert dat de maximale hoeveelheid cRNA wordt teruggewonnen uit het membraan.</li><li> Deze schone biotine-gelabeld cRNA adequaat Transfer naar een nieuwe 1,7 ml centrifugebuis label.</li><li> Bepaal de cRNA concentratie volgens dezelfde procedure als hierboven beschreven tijdens de RNA-isolatie procedure. Noteer de concentratie en 260/280 ratio.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Fragmentatie van de cRNA voor Target Voorbereiding</p><ol><li> Label een 0,5 ml PCR tube met uw identificatie informatie. Overdracht 5 ug van het equivalente hoeveelheid cRNA aan de buis. Voeg genoeg RNase-vrij water om het totale volume tot 16,0 ul te brengen, en daarna 4,0 ul van 5x fragmentatie buffer toe te voegen aan de buis. Het totale volume in de buis moet 20,0 ul worden.</li><li> Vortex de buis en centrifugeer gedurende 10 seconden. Incubeer de buis bij 94 ° C gedurende 30 minuten in een thermocycler. Leg op het ijs na de incubatie.</li></ol><p class="jove_title"> 9. Het beoordelen van de fragmentatie en een gefragmenteerde cRNA met behulp van agarose gel</p><ol><li> Stel de E-gelelektroforese apparaat met behulp van een 1,2% agarosegel prefab. Pre-run de gel gedurende 2 minuten volgens de fabricage van de aanbeveling</li><li> Voeg 14 ul van het water aan elk putje op de E-gel.</li><li> Voeg 2μl van elk monster aan elk putje en pipet op en neer om goed te mengen. Analyseer zowel de versnipperde en gefragmenteerde cRNA van elk monster. Het is het beste om de monsters (versnipperde en gefragmenteerde) belasting in het naburige rijstroken. Noteer de identiteit van elk monster in elke baan.</li><li> Voeg 4 pi van een DNA-ladder (Bioline Gemakkelijk Ladder ik een standaardmaat of Novagen PCR marker) om een baan van de gel</li><li> Run de gel gedurende 20 minuten.</li><li> Visualiseer de E-gel op een transilluminator. Maak een gel beeld.</li></ol><p class="jove_title"> 10. Hybridisatie aan de Gist 2,0 GeneChip</p><p class="jove_step"> Representatieve resultaten:</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong> Figuur 1.</strong> Een gescande Affymetrix Gist GeneChip Image (Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong> Figuur 2.</strong> 2D-spreidingsdiagram van alle genetische transcripts (~ 6700 genen), vergelijking van een controle en behandelde gist data. Elk punt staat voor een enkel gen. Genen gekleurd in paars geven aan genen die differentieel uitgedrukt, terwijl genen gekleurd in het rood zijn dat niet. Beschrijvingen voor het differentieel tot expressie genen zijn geëtiketteerd in de bijbehorende legenda en de meeste zijn betrokken bij de controle van de celcyclus in dit voorbeeld. (Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="Figure 3" /<br /><strong> Figuur 3.</strong> Dit stroomschema illustreert differentieel tot expressie genen in een getroffen biologisch proces. De genen aangegeven met een rode ster geeft de down-gereguleerde genen in de meiotische pad. (De database voor Annotation, visualisatie en geïntegreerde Discovery (DAVID)</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="Figure 4" /<br /><strong> Figuur 4.</strong> Representatieve resultaten van een vulkaan Plot. Controle en behandelde monsters werden vergeleken met een p-waarde cut off van 0,05 en een 1,5 maal uitdrukking veranderen afgesneden. Dit perceel is gegenereerd met behulp van Geospiza's Genesifter software gedoneerd aan de studenten voor educatieve doeleinden.</p>