माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
इस प्रोटोकॉल में, खमीर में जीन की अभिव्यक्ति (<em> Saccharomyces cerevisiae</em>) बदल जाता है oxidative तनाव के लिए जोखिम के अलावा हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच द्वारा प्रेरित के बाद<sub2></sub> हे<sub2></sub>), एक ऑक्सीकरण एजेंट.
Abstract
इस प्रोटोकॉल में, खमीर (Saccharomyces cerevisiae) में जीन की अभिव्यक्ति बदल रहा है हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 2 हे) के अलावा, एक ऑक्सीकरण एजेंट के द्वारा प्रेरित oxidative तनाव के लिए प्रदर्शन के बाद . प्रयोग में, 48 घंटे के लिए खमीर 1/2X YPD 3X ग्लूकोज युक्त शोरबा में उगाया जाता है. संस्कृति एक नियंत्रण और इलाज समूह में विभाजित है. प्रयोग संस्कृति 0.5 मिमी एच 2 हैंक्स में 2 हे के साथ व्यवहार किया जाता है 1 घंटे के लिए खारा (HBSS) buffered. नियंत्रण संस्कृति केवल HBSS के साथ व्यवहार किया जाता है. कुल शाही सेना दोनों संस्कृतियों से निकाली गई है और एक multistep प्रक्रिया के माध्यम से एक बायोटिन लेबल क्रेना उत्पाद में कनवर्ट. अंतिम संश्लेषण उत्पाद UVM माइक्रोएरे कोर सुविधा वापस ले लिया है और Affymetrix खमीर GeneChips संकरित. जिसके परिणामस्वरूप जीन अभिव्यक्ति डेटा जैव सूचना विज्ञान डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में अपलोड कर रहे हैं.
Protocol
<p class="jove_title"> 1. कुल शाही सेना को अलग से<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Enzymatic lysis का उपयोग</p><ol><li> एक RNase मुक्त काम RNase जैप (Ambion) का उपयोग कर क्षेत्र तैयार.</li><li> सीधे lyticase शीशी RNase मुफ्त पानी के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए काम कर रहे 10 यू / उल अंतिम समाधान बनाने के द्वारा नए सिरे से काम lyticase अभिकर्मक तैयार. भंवर में अच्छी तरह से और कई बार पलटना पूरा मिश्रण बीमा. यह 10 इकाइयों / μl समाधान 12 घंटे के लिए स्थिर है.</li><li> ताजा DNase मैं बर्फ पर Qiagen DNase किट और दुकान का उपयोग समाधान तैयार है.</li><li> लेबल अपने पहचान की जानकारी के साथ 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब. ट्यूब में उचित खमीर संस्कृति के 1.5 मिलीलीटर स्थानांतरण.</li><li> 5000 XG (बारे में 3 / 4 पूर्ण गति) में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र. ध्यान से परेशान गोली () के बिना सतह पर तैरनेवाला एक micropipette का उपयोग कर हटा दें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.<strong>**** चरण 4 दोहराएँ अगर गोली का आकार बहुत छोटा है या अगर प्रशिक्षक ने संकेत दिया .****</strong</li><li> गोली, भंवर, और 2 मिनट के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र 1000 μl DEPC पानी जोड़ें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. खमीर गोली से के रूप में संभव के रूप में में तरल पदार्थ की बहुत निकालें.</li><li> खमीर गोली और भंवर निम्न जोड़ें मिश्रण.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> SGbuffer</td><td> 10 μl</td></tr><tr><td> Lyticasesolution (10u/μl)</td><td> 30 μl</td></tr></tbody></table</li><li> कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.</li><li> धीरे ज़ुल्फ़ ट्यूब spheroplasts उत्पन्न हर 10 मिनट. Spheroplasts धीरे संभाला होना चाहिए. पूरा spheroplasting निरीक्षण के लिए खुर्दबीन के नीचे खमीर जांच करते हैं. जबकि माइक्रोस्कोप स्लाइड पर खमीर जांच, 0.1% की एसडीएस एक छोटी राशि जोड़ने के लिए खमीर के कारण प्रफुल्लित करने के लिए और सही क्षेत्रों (नवोदित कोशिकाओं के लिए भी) के रूप में. यह इंगित करता है कि सेल दीवारों पचा किया गया है.</li><li> ट्यूब और भंवर 350 μl ख RLT बफर जोड़ें<strongसख्ती></strong> 1 मिनट के लिए. सुनिश्चित करें कि आपका ट्यूब कस कर ढक्कन धारण करके छाया हुआ है बंद कर दिया, जबकि vortexing. यह प्रक्रिया spheroplasts lyse जाएगा.</li><li> ट्यूब और संक्षिप्त भंवर करने के लिए 250 μl 100% इथेनॉल जोड़ें. वेग से इथेनॉल के अलावा के बाद फार्म कर सकते हैं, लेकिन इस शाही सेना के संग्रह को प्रभावित नहीं करेगा.</li><li<strong> शाही सेना इकट्ठा:</strong> लेबल अपनी पहचान के साथ एक RNeasy स्पिन स्तंभ ध्यान informationand समाधान के सभी 10 कदम से स्पिन स्तंभ का उपयोग कर एक micropipette के लिए स्थानांतरण. Pipet टिप के साथ सिलिका झिल्ली छू नहीं सावधान रहो. ट्यूब बंद करें और 15 सेकंड के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र. नमूने में शाही सेना स्पिन स्तंभ के सिलिका झिल्ली का पालन करना होगा.</li><li> संग्रह ट्यूब से स्पिन स्तंभ निकालें. Pipet तरल के माध्यम से गुजारें (संग्रह ट्यूब में तरल) वापस स्पिन स्तंभ पर और फिर अपकेंद्रित्र. संग्रह ट्यूब त्यागें (तरल पदार्थ के माध्यम से प्रवाह के साथ) और एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ जगह.</li><li> स्पिन स्तंभ के लिए 350 μl बफर RW1 जोड़ें. यह समाधान के लिए शाही सेना को धोने और लवण और भंग सेलुलर मलबे को हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है. ट्यूब बंद करें और 15 सेकंड के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र.</li><li<strong> डीएनए पचाने:</strong> अपकेंद्रित्र से स्पिन स्तंभ निकालें, ट्यूब ढक्कन खोलने के स्पिन स्तंभ झिल्ली के बीच DNase मैं समाधान की 80 μl जोड़ने. यह कदम नमूने में किसी भी gDNA पचाने में होगा. स्तंभ ढक्कन बंद करें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.</li><li> एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब स्पिन स्तंभ स्थानांतरण.</li><li<strong> सफाई और शाही सेना धोने:</strong> स्पिन स्तंभ के लिए 350 μl बफर RW1 जोड़ें और 15 सेकंड के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र.</li><li> संग्रह ट्यूब त्यागें और एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ जगह.</li><li> स्पिन स्तंभ को 500 μl RPE बफर जोड़ें सिलिका झिल्ली पर शाही सेना धोने. पूरी गति से बंद ट्यूब और 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र<em>.</em</li><li> संग्रह ट्यूब त्यागें और एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ जगह.</li><li> सिलिका झिल्ली फिर से धो स्पिन स्तंभ के लिए एक और 500 μl RPE बफर जोड़ने के द्वारा. ट्यूब बंद करें और 15 सेकंड के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र.</li><li> एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह और 1 मिनट के लिए पूरी रफ्तार से एक microcentrifuge में ट्यूब अपकेंद्रित्र में स्पिन स्तंभ प्लेस करने के लिए सुनिश्चित करें किसी भी अवशिष्ट तरल सिलिका झिल्ली से हटा दिया है.</li><li<strong> शाही सेना पुनर्प्राप्त:</strong> एक नया 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कि आपके नमूना जानकारी के साथ चिह्नित किया गया है RNeasy स्पिन स्तंभ स्थानांतरण. ध्यान दें कि नए ट्यूब की टोपी अगले कुछ कदम के लिए खुला छोड़ दिया जाएगा.</li><liध्यान> pipet 30 μl पानी RNase मुक्त<strongकेंद्र पर सीधे></strong> सिलिका झिल्ली की.<strong> Pipet टिप के साथ सिलिका झिल्ली मत छुओ (चित्र देखने के लिए)</strong>. बारीकी से देखो के रूप में आप इस कदम का प्रदर्शन. दोनों हाथों का प्रयोग करें pipet गाइड. यकीन है कि पानी झिल्ली पर समान रूप से वितरित किया जाता है.</li><li> कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए स्पिन स्तंभ सेते हैं. 30 सेकंड के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र.</li><li> ध्यान से 30 μl कि 1.7 मिलीलीटर ट्यूब में बरामद 22 ऊपर चरण में स्पिन के रूप में एक ही स्तंभ के सिलिका झिल्ली के केंद्र पर वापस हस्तांतरण. स्तंभ एक ही 1.7 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में वापस प्लेस और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते हैं. पूर्ण गति से 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. इस दोहरे elution सुनिश्चित करता है कि शाही सेना के अधिक से अधिक राशि झिल्ली से बरामद किया है.</li><li> लेबल दो नए अपने पहचान की जानकारी के साथ 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और इन ट्यूबों के बरामद आरएनए नमूना के सभी हस्तांतरण.</li><li> अन्य लेबल ट्यूब करने के लिए इस नमूने के 4 μl स्थानांतरण. यह नमूना UVM वापस Nanodrop मात्रा का ठहराव और आरएनए गुणात्मक मूल्यांकन (यह आरएनए मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण संस्थान भाग लेने साइट पर प्रदर्शन को मान्य है) के लिए ले जाया.</li><li> बर्फ पर सभी नमूनों प्लेस.</li><li<strong> शाही सेना मात्रा:</strong> Eppendorf Biophotometer का प्रयोग, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर शाही सेना के नमूने के एक 1 से 50 कमजोर पड़ने पर absorbance के उपाय (नमूना 1μl + 49μl एच<sub2></sub> हे).</li><li> शाही सेना (Invitrogen) ई – जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए 1.2% मिल में बना हुआ agarose जेल का उपयोग कर गुणवत्ता का मूल्यांकन.</li><li<strong> शाही सेना गुणात्मक विश्लेषण:</strong> ई – जेल वैद्युतकणसंचलन तंत्र सेट. 2 मिनट के लिए निर्माता की प्रक्रिया के अनुसार जेल के पूर्व चलाने. पूर्व चलाने के बाद, जेल कंघी को हटा दें और अच्छी तरह से 1μl प्रत्येक नमूने के प्रत्येक अच्छी तरह से बाद प्रत्येक के लिए पानी की 14 μl जोड़ने. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. एक अच्छी तरह से आकार बाद में तुलना (Bioline आसान सीढ़ी मैं मानक या Novagen पीसीआर मार्कर आकार) के लिए एक उपयुक्त आकार के डीएनए सीढ़ी का प्रयोग करें. रिकार्ड जो नमूना प्रत्येक गली में है. 20 मिनट के लिए जेल चलाएँ.</li><li> जेल की एक तस्वीर ले लो.</li></ol><p class="jove_title"> 2. पहले Strand सीडीएनए संश्लेषण</p><ol><li> अपनी पहचान की जानकारी के साथ 0.5 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब लेबल. शाही सेना की एकाग्रता ऊपर प्रयोग से निर्धारित से नमूने की मात्रा की गणना 3.0 स्नातकीय प्राप्त करने के लिए. ट्यूब के लिए इस राशि स्थानांतरण. RNase मुक्त पर्याप्त पानी जोड़ें 11.0 उल मात्रा लाने के लिए.</li><li> 1.0 μl T7 oligo जोड़ें (डीटी)<sub24></sub> ट्यूब के लिए अभिकर्मक. Pipet टिप मात्रा करने के लिए इस कदम के दौरान विशेष ध्यान करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी अभिकर्मक स्थानांतरित किया गया था भुगतान करने के लिए सुनिश्चित करें. ट्यूब और 5 सेकंड के लिए पूरी गति में अपकेंद्रित्र भंवर. एक 70 पर सेट thermocycler में ट्यूब प्लेस ° सी 10 मिनट के लिए.</li><li> जबकि 70 ° सी ऊष्मायन प्रगति में है, एक नया ट्यूब में पहली भूग्रस्त मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं. निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ना सुनिश्चित करें<strong> आदेश में,</strong> भंवर और अपकेंद्रित्र 5 सेकंड और बर्फ पर ट्यूब की जगह के लिए पूरी गति पर है.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> पहले कतरा मास्टर मिश्रण:</strong</td></tr><tr><td> FirstStrandBuffer5X</td><td> 4 μl</td></tr><tr><td> 0.1MDTT</td><td> 2 μl</td></tr><tr><td> 10mMdNTP</td><td> 1 μl</td></tr><tr><td> SuperscriptII</td><td> 1 μl</td></tr></tbody></table<br /> P2 micropipette प्रयोग 2 μl या उससे कम की मात्रा को मापने.</li><li° चरण 2 में सी ऊष्मायन> 70 के बाद पूरा हो गया है, ट्यूब और एक thermocycler में सेते 42 ° C पर 60 मिनट के लिए पहली कतरा मास्टर चरण 3 में बनाया मिश्रण के 8 μl जोड़ने. जब पहली कतरा संश्लेषण ऊष्मायन समाप्त हो गया है, बर्फ पर ट्यूब जगह है. इस ऊष्मायन के दौरान, दूसरा कतरा मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं.</li></ol><p class="jove_title"> 3. दूसरा Strand सीडीएनए संश्लेषण</p><ol><li> एक नया ट्यूब में निम्नलिखित दूसरे कतरा मास्टर मिश्रण बनाओ. यह बर्फ पर रखें. भंवर और उपयोग करने से पहले सभी अभिकर्मकों अपकेंद्रित्र. सूचीबद्ध क्रम में अभिकर्मकों जोड़ें.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> दूसरा कतरा मास्टर मिश्रण</strong</td></tr><tr><td> DEPC जल</td><td> 91 उल</td></tr><tr><td> 5X दूसरा Strand बफर</td><td> उल 30</td></tr><tr><td> DNTPs (10mm)</td><td> 3 उल</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> डीएनए ligase (10U/ul)</td><td> 1 उल</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> डीएनए पोलीमरेज़ I (10U/ul)</td><td> 4 उल</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> RNase एच (2U/ul)</td><td> 1 उल</td></tr></tbody></table</li><li> भंवर ट्यूब और पूरी गति से अपकेंद्रित्र 5 सेकंड के लिए.</li><li> जब 42 ° सी ऊष्मायन समाप्त हो गया है, नमूना शाही सेना और पहली कतरा अभिकर्मकों युक्त ट्यूब दूसरा कतरा मास्टर मिश्रण के सभी 130 μl हस्तांतरण. भंवर और कमरे के तापमान पर 5 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र. 2 घंटे के लिए 16 ° C thermocycler में ट्यूब सेते हैं.</li><li> 2 घंटे ऊष्मायन के अंत में और जबकि नमूना 16 पर अभी भी डिग्री सेल्सियस, ट्यूब 2μl टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ अभिकर्मक जोड़ने. संक्षेप में भंवर और 16 ° C पर अधिक से अधिक 5 अतिरिक्त मिनट के लिए ट्यूब और सेते अपकेंद्रित्र. अब तो 5 मिनट incubating सीडीएनए टी -4 के 3'to 5'exonuclease गतिविधि पोलीमरेज़ करने के लिए कारण की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं.</li><li> 5 मिनट ऊष्मायन के अंत में, 10 μl 0.5 एम EDTA जोड़ने के लिए टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया को रोकने के. -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब स्टोर</li></ol><p class="jove_title"> 4. सीडीएनए precipitating</p><ol><li> एक मिनट के लिए पूरी गति में एक चरण बंद जेल ट्यूब अपकेंद्रित्र बीमा जेल ट्यूब के नीचे है.<strong> भंवर चरण ताला ट्यूब नहीं</strong>.</li><li> के 162 μl जोड़ें<strong> नीचे की परत</strongपीएच से 8.0 Tris 5 सेकंड के लिए दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया ट्यूब और भंवर की सामग्री Phenol / / क्लोरोफॉर्म Isoamyl शराब (पीसीआई) सामग्री (ऊपर प्रयोग से सीडीएनए संश्लेषण कदम की कुल मात्रा का मिश्रण buffered 162 उल पीसीआईघड़ी कदम जलीय और कार्बनिक मिश्रण के बराबर मात्रा की आवश्यकता है).</li><li> सीडीएनए-PCI मिश्रण के सभी चरण ताला जेल ट्यूब एक micropipet का उपयोग करने के लिए स्थानांतरण.<strong> नहीं भंवर DO</strong> चरण ताला जेल ट्यूब.</li><li2 मिनट के लिए पूरी गति पर> अपकेंद्रित्र.</li><li> एक नया 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब लेबल. चरण ताला जेल ट्यूब से नए लेबल 1.7 मिलीलीटर ट्यूब के ऊपर परत हस्तांतरण एक micropipet का प्रयोग करें. परत के रूप में संभव के रूप में में ज्यादा एकत्र की कोशिश करो.</li><li> 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और भंवर निम्नलिखित जोड़ें.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> इथेनॉल (100%)</td><td> उल 405</td></tr><tr><td> राष्ट्रीय राजमार्ग<sub> 4</sub> OAC</td><td> 80 उल</td></tr><tr><td> गोली पेंट</td><td> 1 उल</td></tr></tbody></table</li><li> अपकेंद्रित्र में बाहर का सामना करना पड़ ट्यूब के काज के साथ ट्यूब प्लेस और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र.</li><li> धीरे सीडीएनए गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा अपकेंद्रित्र से ट्यूब हटायें. गोली गुलाबी हो सकता है और लगभग नमक की एक अनाज के आकार और काज के तहत ट्यूब की तरफ होना चाहिए. बर्फ पर रखें और तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ना.</li></ol><p class="jove_title"> 5. सीडीएनए गोली क्लीनिंग</p><ol><li> P1000 micropipet का प्रयोग, ध्यान से ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला के सभी हटा. गोली को परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहें. याद रखें कि गोली अपने नमूना है!</li><li> 500μl ठंड 80% इथेनॉल (-20 में संग्रहीत जोड़ें<sup> °</sup> सी ट्यूब) फ्रीजर. धीरे ट्यूब टोपी और यह पलटना धीरे कई बार. अपने गोली बहुत बारीकी से देखो. यदि गोली अलग हो जाता है, ट्यूब रैक में वापस और जगह गोली नीचे के लिए व्यवस्थित. वैकल्पिक रूप से, आप पूरी गति से 15 सेकंड के लिए ट्यूब गोली ट्यूब के नीचे करने के लिए नीचे वापस करने के लिए मिलता है अपकेंद्रित्र सकता है.</li><li> एक P1000 micropipet का प्रयोग, ध्यान से इथेनॉल बहुत सावधान गोली परेशान नहीं होने से हटा दें. ट्यूब युक्ति के रूप में ज्यादा तरल हटाने के लिए संभव के रूप में सक्षम है.</li><li> 80% इथेनॉल एक नए विभाज्य के साथ चरण 2 और 3 दोहराएँ.</li><liअंत में> एक P1000 micropipet उपयोग करके इथेनॉल के सभी संभव हटा. पूरी रफ्तार से 5 सेकंड के लिए ट्यूब और अपकेंद्रित्र एक P20 micropipet का उपयोग करने के लिए, इथेनॉल के पिछले कुछ microliters हटा दें. लक्ष्य को गोली परेशान बिना संभव के रूप में ज्यादा इथेनॉल के रूप में दूर है.</li><li> रैक या 10-20 लुप्त हो जाना मिनट शेष इथेनॉल के लिए सुखाने बॉक्स में खुला ट्यूब प्लेस. सूखे गोली आसानी से खो दिया है एक बार यह सूखा है. Becareful ट्यूब धीरे संभाल. जब किया, टोपी करीब है. सूखे गोली कल्पना की पुष्टि के लिए यह ट्यूब में मौजूद है.</li><li> RNase मुफ्त पानी और बर्फ पर ट्यूब की जगह के 22 μl में गोली Resuspend.</li></ol><p class="jove_title"> 6. InVitroTranscription (IVT)</p><ol><li> ENZO bioarray किट सभी सीडीएनए से बायोटिन लेबल क्रेना तैयार की जरूरत अभिकर्मकों शामिल हैं.<br /> एक मास्टर mixfor पूरे वर्ग follows.The प्रशिक्षक के रूप में तैयार हो जाएगा इस मिश्रण तैयार या वर्ग से किसी को नामित करेंगे. यह एक RNase मुक्त क्षेत्र में किया जाना चाहिए.<br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> राशि / नमूना</td><td> # नमूने</td><td> कुल</td></tr><tr><td> एक अभिकर्मक [10x रिएक्शन बफर]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 अभिकर्मक [10x Biotinnucleotides]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 अभिकर्मक [10x डीटीटी]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 अभिकर्मक [10x RNase अवरोध करनेवाला]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 अभिकर्मक [20x T7 शाही सेना पोलीमरेज़]</td><td> 2μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> कुल मात्रा</td><td> 18 μl</td><td></td><td></td></tr></tbody></table<br /><strong> नोट:</strong> नमूने प्लस एक की संख्या के लिए पर्याप्त मास्टर मिश्रण तैयार करें. यह pipetting प्रयोजनों के लिए पर्याप्त बीमा होगा.</li><li> एक 0.5 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब लेबल. ट्यूब और ऊपर pipet में निम्नलिखित मिश्रण और मिश्रण करने के लिए नीचे कई बार. एक अपकेंद्रित्र में 5 सेकंड के लिए पूरी गति में स्पिन ट्यूब के नीचे करने के लिए सभी अभिकर्मकों मिल.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> सीडीएनए मिश्रण</td><td> 22μl</td></tr><tr><td> Enzomastermix [fromabove]</td><td> 18μl</td></tr><tr><td> TotalVolume</td><td> 40μl</td></tr></tbody></table</li><li> 37 में डिग्री सेल्सियस for16 घंटे में thermocycler ट्यूब सेते हैं. जब प्रतिक्रिया पूरा हो गया है, -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना की दुकान</li></ol><p class="jove_title"> 7. Biotinylated क्रेना क्लीनिंग</p><ol><li> एक नया 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब पूरे क्रेना नमूना स्थानांतरण. RNase मुफ्त पानी के 60 μl और 350 μl RLT और 5 सेकंड के लिए बफर भंवर जोड़ें.</li><li> 250 μl 100% इथेनॉल और भंवर फिर से जोड़ें.</li><li> एक RNeasy स्पिन स्तंभ लेबल और स्तंभ के लिए पूरे क्रेना नमूना हस्तांतरण. सिलिका झिल्ली pipet की नोक छू नहीं सावधान रहो. ढक्कन और पूरी गति से 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र बंद.</li><li> संग्रह ट्यूब से स्पिन स्तंभ निकालें. Pipet तरल के माध्यम से गुजारें (संग्रह ट्यूब में तरल) वापस स्पिन स्तंभ पर और 15 सेकंड के लिए फिर से अपकेंद्रित्र.</li><li> एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह और स्पिन स्तंभ पर pipet RPE बफर के 500 μl ट्यूब में स्पिन स्तंभ रखें. ट्यूब बंद करें और 15 सेकंड के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र. संग्रह और तरल के माध्यम से पारित ट्यूब त्यागें. एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ रखें.</li><li> स्पिन स्तंभ के लिए एक और 500 μl RPE बफर जोड़ें.</li><li> एक नया संग्रह ट्यूब में स्थानांतरण स्पिन स्तंभ और स्तंभ 2 मिनट के लिए पूरी गति में "सुखाने" स्पिन प्रदर्शन.</li><li> अपनी पहचान की जानकारी के साथ एक नया 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब लेबल. इस ट्यूब स्पिन स्तंभ स्थानांतरण.</li><li> Pipet केंद्र RNeasy सिलिका और 1 मिनट के लिए कमरे Temp पर झिल्ली सेते पर 30 μl RNase मुक्त पानी. ट्यूब और पूर्ण गति से 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र बंद.</li><li> ध्यान से 30 μl 1.7 मिलीलीटर ट्यूब में बरामद किया है एक ही स्पिन स्तंभ के RNeasy सिलिका झिल्ली के केंद्र पर वापस हस्तांतरण. स्तंभ एक ही 1.7 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में वापस प्लेस और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते हैं. पूर्ण गति से 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. इस दोहरे elution सुनिश्चित करता है कि क्रेना की अधिकतम राशि झिल्ली से बरामद किया है.</li><li> एक नया 1.7 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और लेबल के लिए यह साफ बायोटिन लेबल क्रेना उचित स्थानांतरण.</li><li> क्रेना एकाग्रता का उपयोग कर एक ही प्रक्रिया के रूप में शाही सेना के अलगाव की प्रक्रिया के दौरान ऊपर उल्लिखित का निर्धारण करते हैं. एकाग्रता और 260/280 अनुपात रिकॉर्ड.</li></ol><p class="jove_title"8>. लक्ष्य तैयार करने के लिए क्रेना fragmenting</p><ol><li> अपनी पहचान की जानकारी के साथ 0.5 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब लेबल. ट्यूब क्रेना के बराबर राशि का 5 स्नातकीय स्थानांतरण. RNase मुक्त पर्याप्त पानी जोड़ें 16.0 उल कुल मात्रा लाने के लिए, और फिर ट्यूब को 5X विखंडन बफर के 4.0 μl जोड़ने. ट्यूब में कुल मात्रा 20.0 उल होना चाहिए.</li><li> भंवर ट्यूब और 10 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र. 94 ° सी में एक thermocycler में 30 मिनट के लिए ट्यूब को सेते हैं. निम्नलिखित ऊष्मायन बर्फ पर रखो.</li></ol><p class="jove_title"9>. खंडित और Unfragmented क्रेना agarose जेल का उपयोग कर का आकलन</p><ol><li> ई – जेल वैद्युतकणसंचलन तंत्र का उपयोग एक 1.2% मिल में बना हुआ agarose जेल सेट. 2 मिनट के लिए निर्माण की सिफारिश के अनुसार जेल के पूर्व रन</li><li> ई – जेल पर एक अच्छी तरह से पानी के 14 μl जोड़ें.</li><li> प्रत्येक अच्छी तरह से और pipet प्रत्येक नमूना के 2μl जोड़ें और नीचे मिश्रण अच्छी तरह से. प्रत्येक नमूने के दोनों खंडित और unfragmented क्रेना विश्लेषण. यह सबसे अच्छा है पड़ोसी गलियों में नमूने (खंडित और unfragmented) लोड. प्रत्येक गली में प्रत्येक नमूने की पहचान रिकॉर्ड.</li><li> जेल के एक लेन एक डीएनए सीढ़ी (Bioline आसान सीढ़ी मैं मानक या Novagen पीसीआर मार्कर आकार) के 4 μl जोड़ें</li><li> 20 मिनट के लिए जेल चलाएँ.</li><li> Transilluminator पर ई – जेल कल्पना. एक जेल तस्वीर ले लो.</li></ol><p class="jove_title"> 10. खमीर 2.0 GeneChip के लिए संकरण</p><p class="jove_step"> प्रतिनिधि परिणाम:</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong> चित्रा 1.</strongएक स्कैन Affymetrix खमीर GeneChip छवि (Affymetrix GeneChip ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strongFigure2>.</strong> सभी आनुवंशिक टेप (~ 6700 जीन) की 2D तितर बितर भूखंड, नियंत्रण और इलाज खमीर डेटा की तुलना. प्रत्येक बिंदु एक जीन का प्रतिनिधित्व करता है. बैंगनी रंग में रंग जीन जीन है कि विभिन्न जबकि नहीं कर रहे हैं लाल रंग में रंग जीनों व्यक्त कर रहे हैं संकेत मिलता है. विभिन्न व्यक्त जीनों के लिए वर्णन इसी किंवदंती में चिह्नित कर रहे हैं और सबसे अधिक इस उदाहरण में सेल चक्र के नियंत्रण में शामिल हैं. (Affymetrix GeneChip ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="Figure 3" /<br /><strong> चित्रा 3.</strong> यह प्रवाह संचित्र एक प्रभावित जैविक मार्ग में विभिन्न व्यक्त जीनों को दिखाता है. एक लाल सितारा के साथ संकेत जीन meiotic मार्ग में नीचे विनियमित जीन संकेत मिलता है. (एनोटेशन, विज़ुअलाइज़ेशन और एकीकृत (डिस्कवरी डेविड के लिए धन्यवाद)</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="Figure 4" /<br /><strong> चित्रा 4.</strong> एक ज्वालामुखी प्लॉट के प्रतिनिधि परिणाम. नियंत्रण और इलाज के नमूने .05 के कट और एक 1.5 गुना अभिव्यक्ति परिवर्तन काट पी मूल्य के साथ तुलना में थे. इस साजिश Geospiza Genesifter कृपया शैक्षिक उद्देश्यों के लिए छात्रों के लिए दान सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पन्न किया गया.</p>
Discussion
<p class="jove_step"> अनुप्रयोगों और महत्व है.</p><p class="jove_content"> वरमोंट जेनेटिक्स नेटवर्क आउटरीच कार्यक्रम, वरमोंट के विश्वविद्यालय में, राज्य भर में आठ साथी बेक्कालॉरेट कॉलेजों के स्नातक आउटरीच आयोजित. VGN आउटरीच कोर के लक्ष्य वरमोंट के राज्य में स्नातक से नीचे के राज्य के अत्याधुनिक वैज्ञानिक तकनीक और संसाधनों के अनुभवों पर हाथ का उपयोग करने के लिए बेनकाब है. माइक्रोएरे वर्णित मॉड्यूल 2003 में विकसित किया गया था और बाद में उन्नयन. यह एक मिनी पाठ्यक्रम के रूप में की पेशकश की गई है या भाग लेने वाले संस्थानों में मौजूदा प्रयोगशाला पाठ्यक्रम में एकीकृत है.</p><p class="jove_content"> यह परियोजना, अनुसंधान विश्वविद्यालय कोर और स्नातक कॉलेजों के बीच, शिक्षा और अनुसंधान के क्षेत्र में सहयोग को बढ़ावा देता है. राज्य भर में माइक्रोएरे आउटरीच पाठ्यक्रम में इजाफा किया है और मुख्य सुविधाओं, संकाय और छात्रों के लिए अनुसंधान और नेटवर्किंग के अवसरों का सृजन.</p><p class="jove_content"> के रूप में स्नातक संकाय कार्यक्रम अपनाने के लिए वे उपयुक्त Affymetrix GeneChips और उपलब्ध एनोटेशन प्रदान अद्वितीय प्रयोगों के डिजाइन के लिए प्रोत्साहित कर रहे हैं. प्रयोगशाला पुस्तिका, संदर्भ और PowerPoint प्रस्तुतियों सहित इस मॉड्यूल के लिए सभी जानकारी उपलब्ध ऑनलाइन (वरमोंट जेनेटिक्स नेटवर्क, 2008) हैं.</p><p class="jove_step"> क्रिटिकल कदम:</p><p class="jove_content"<em> Spheroplasting:</em> यह माइक्रोस्कोप के अंतर्गत सफल spheroplasting निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. एसडीएस के उपयोग अत्यधिक लाभकारी है के रूप में यह खमीर spheroids में जिसके परिणामस्वरूप सूजन का कारण बनता है. यह महत्वपूर्ण है निरीक्षण करने के लिए कि नवोदित कोशिकाओं spheroids के रूप में अच्छी तरह से फार्म. यदि आंशिक spheroplasting मनाया जाता है, lyticase के साथ एक विस्तारित उपचार की सिफारिश की है.</p><p class="jove_content"<em> गोली सफाई:</em> वर्षण प्रतिक्रिया और बाद में इथेनॉल धोने कदम के दौरान, यह बहुत आसान है सीडीएनए गोली खोना. चरम देखभाल और गोली के लिए सावधानीपूर्वक ध्यान जरूरी है.</p><p class="jove_content"<em> झिल्ली के केंद्र के लिए पानी को लागू:</em> झिल्ली से शाही सेना elution कदम के दौरान, यह "धार" पानी की 30 सिलिका झिल्ली के केंद्र के लिए सीधे μl के लिए महत्वपूर्ण है. यदि यह पूरा नहीं है, स्तंभ और centrifuged किया जा सकता है परिणामस्वरूप elutant किया जा सकता है सिलिका झिल्ली के लिए फिर से फिर से लागू है. यह आवश्यक के रूप में कई बार के रूप में दोहराया जा सकता है है.</p><p class="jove_step"> संशोधन और उत्पाद Substitutions:</p><ol><li> वैकल्पिक शाही सेना के सफाई कॉलम प्रतिस्थापित किया जा सकता है. उदाहरण प्रस्तुत करने का आसानी यूएसबी और Invitrogen शुद्ध लिंक शाही सेना, किट, और ओमेगा शाही सेना सफाई किट के लिए कुछ नाम हैं.</li><li> Schizosaccharomyces pombe एक वैकल्पिक खमीर है. Affymetrix GeneChip एक ही चिप पर दोनों जीनोम होता है</li><li> विभिन्न उपचार और समय इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दवा उपचार, तापमान उपचार, विरोधी oxidants, आदि के उपचार बार भी समायोजित किया जा सकता है शामिल हो सकते हैं.</li><li> DNase उपचार क्योंकि तरीकों एक oligo प्राइमर (डीटी) का उपयोग रोजगार वर्णित नहीं किया जा आवश्यकता हो सकती है.</li><li> यह वही 30 μl विभाज्य के साथ स्तंभ बंद एक शाही सेना के एक डबल elution प्रदर्शन की आवश्यकता नहीं है. एक बार जब लगभग हमेशा पर्याप्त है. यह करने के लिए बीमा है कि एक पूरी वसूली प्राप्त की है का सुझाव दिया है. इसके अतिरिक्त, स्तंभ से शाही सेना elute पूर्व गर्म पानी 65 से किया जा सकता है डिग्री सेल्सियस करने के लिए आगे सिलिका स्तंभ से शाही सेना को ठीक करने की क्षमता में वृद्धि.</li><li> कई तरीकों के लिए शाही सेना यों उपलब्ध हैं. Eppendorf और केवल Nanodrop उपयोग के अपने आसानी के लिए चुना गया और सटीकता परीक्षण किया.</li><li> Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन कई मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग किया जा. ई – जेल की आवश्यकता नहीं बल्कि वांछनीय है क्योंकि यह RNase मुक्त करता है और जेल solidification इंतज़ार कर समय की आवश्यकता नहीं है.</li><li> उत्पादों के लिए आदेश जानकारी की आपूर्ति किया गया है. हालांकि, कई सामान्य अभिकर्मकों एकाधिक विक्रेताओं से आदेश दिया जा सकता है.</li><li> एक साइकिल सीडीएनए अभिकर्मकों अलग से खरीदा जा सकता है कि अगर और अधिक लागत प्रभावी है.</li><li> अन्य लक्षित प्रस्तुत करने के तरीके हैं, लेकिन हमें लगता है कि यह एक छात्र के लिए शिक्षण के अवसर प्रदान करता है.</li></ol>
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> वरमोंट विश्वविद्यालय, वरमोंट जेनेटिक्स नेटवर्क. इस प्रकाशन वरमोंट जेनेटिक्स नेटवर्क के द्वारा ही संभव बनाया गया था अनुदान P20 ब्रिन और अनुसंधान संसाधन के लिए theNational केंद्र (NCRR), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के के एक घटक (NIH) के INBRE कार्यक्रम से अनुदान P20 संख्या RR16462 कार्यक्रम से संख्या RR16462 के माध्यम से, . इसकी सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और NCRR या एनआईएच की आधिकारिक दृश्य जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.</p><p class="jove_content"> हम उनके सहयोग और इनपुट के लिए इस मॉड्यूल Castleton राज्य कॉलेज, ग्रीन माउंटेन कॉलेज, जॉनसन राज्य कॉलेज, लिंडन राज्य कॉलेज, Marlboro कॉलेज, मिडलबरी कॉलेज, नॉर्विच विश्वविद्यालय और सेंट माइकल के कॉलेज को परिष्कृत करने में हमारे सभी भाग लेने आउटरीच संस्थानों को धन्यवाद देना चाहूंगा.</p>
Materials
| General Laboratory Equipment | Company | Product number |
| Spetrophotometer | ||
| Thermocyler | ||
| Microcentrifuge | ||
| Vortex | ||
| Stir Plates (2) | ||
| P-10s pipettors | ||
| P-20’s pipettors: | ||
| P-200’s pipettors: | ||
| P-1000’s pipettors: | ||
| Camera and transilluminator | ||
| Supplies – recommended | ||
| E-Gel Apparatus | Invitrogen | G6000-08 |
| E-Gels | Invitrogen | G6018-02 |
| Axygen 1.7 ml. Clear | Krackler | 383-MCT175C |
| Axygen 0.5 ml clear tubes | Krackler | 383-MCT060C |
| Axygen 2ml capture tubes | Krackler | 383-MCT200NC |
| boxes of P-10 ART tips: | CLP | BT10XL |
| Boxes of P-100 ART tips: | CLP | BT200 |
| Boxes of P-20 ART Tips: | CLP | BT20 |
| Boxes of P-1000 ART Tips: | CLP | BT1000 |
| Yeast Chips | ||
| General Laboratory Supplies | ||
| 25 ml sterile disposable pipets- | ||
| 5ml sterile disposable pipets- | ||
| Microfuge tube racks | ||
| KimWipes: | ||
| Lab Coats | ||
| Stir Bars | ||
| Culture flasks | ||
| Innoculating loops | ||
| Sharpies | ||
| Gloves | ||
| Autoclave tape | ||
| Stirrer bars | ||
| Reagents | ||
| 30% Hydrogen Peroxide | EMD Millipore | 386790 |
| HBSS without Ca, Mg, or dye | Sigma-Aldrich | H6648-100ml |
| Qiagen Rneasy Mini Kit: | Qiagen | 74104 |
| Qiagen DNase Kit: | Qiagen | 79254 |
| Rnase Remover | Denville Scientific | D1180 |
| Harleco Alcohol 100% | EMD Millipore | 65347 |
| ENZO IVT Kit | ENZO | ENZ-42655-10 |
| Lyticase: one bottle | VWR | IC19012310 |
| Water, Cell Culture grade | EMD Millipore | 4.86505 |
| Yeast culture: | ATCC | 18824 |
| YPD broth powder | EMD Millipore | 4.8504 |
| D(+) Glucose, Anhydrous | EMD Millipore | 346351 |
| Sorbitol | EMD Millipore | 56755 |
| EDTA | EMD Millipore | 4005 |
| SDS solution, 20% | EMD Millipore | 7990-OP |
| Pellet Paint | EMD Millipore | 69049 |
| PCI RNase DNase free (7 aliquots): | Fisher | AC32711-500 |
| 7.5M NH4OAc | Fisher | ICN1987 5980 |
| Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA) | ||
| Trizma Base | Fiaher | 50-899-90034 |
| KOAc | Fisher | NC9757725 |
| MgOA | Fisher | NC9681042 |
| Loading Dye | Invitrogen | 10482055 |
| PCR Markers | EMD Millipore | 69278-3 |
| Phase Lock Gels | Fisher | FP2302820 |
| One-Cycle cDNA Kit | Invitrogen | A10752-030 |
| Includes; | ||
| E. coli DNA Pol | ||
| dNTP’s | ||
| T4 DNA Pol. | ||
| T-7 oligod(T) | ||
| 0.5ml EDTA pH 8.0 | ||
| First Strand Buffer | ||
| E. Coli RNaseH | ||
| Second Strand Buffer | ||
| E. Coli DNA ligase | ||
| SuperScript II | ||
| DTT | ||
References
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).
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- D’Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
- Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis. J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).
- Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).
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- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Dennis, G., Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).
Cite This Article
Tighe, S., Hunter, T., Reed, P., Murray, J. Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (50), e2585, doi:10.3791/2585 (2011).