Flödescytometri Rening av Mouse meiotiska celler

Summary

En effektiv metod för att få renat livskraftiga meiotiska fraktioner från mus testiklarna beskrivs, som kombinerar en raffinerad cell dissociation protokoll med fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS). Denna metod tar fördel av skillnader i DNA-innehåll och nukleära densiteten av diskreta meiotiska fraktioner.

Abstract

Heterogena karaktär typer av celler i testiklarna och frånvaron av meiotiska modeller cellodling har varit betydande hinder för att studera den unika differentiering program som manifesteras under meios. Två huvudsakliga metoder har utvecklats för att rena, i varierande grad, olika meiotiska fraktioner från både vuxna och växande djur: elutriation eller Staput (sedimentering) med hjälp av BSA och / eller Percoll lutningar. Båda dessa metoder är beroende av cellens storlek och densitet för att separera meiotiska celler ^1-5. Totalt sett, med undantag för några cellpopulationer ^6, dessa protokoll inte ge tillräcklig renhet många meiotiska cellpopulationer som är nödvändiga för detaljerade molekylära analyser. Dessutom med sådana metoder oftast en typ av meiotiska celler kan renas vid en given tidpunkt, vilket ger en extra nivå av komplexitet vad avser reproducerbarhet och homogenitet när man jämför meiotiska cellprover.

Här beskriver vi en raffinerad metod som gör att man kan lätt visualisera, identifiera och rena meiotiska celler, från könsceller till runda spermatider, med hjälp av FACS kombination med Hoechst 33.342 färgning ^7,8. Denna metod ger en övergripande bild av hela meiotiska processen och gör att man kan mycket rena livskraftiga celler från de flesta steg i meios. Dessa renas celler kan sedan analyseras i detalj för molekylära förändringar som följer med progression genom meios, till exempel förändringar i genuttryck ^9,10 och dynamiken i nukleosomen beläggning på hotspots i meiotiska rekombination ^11.

Protocol

Detta protokoll kan delas i två stora steg: (1) av dissociation och Hoechst 33.342 färgning av musen testiklarna celler följt av, om nödvändigt, (2) FACS sortering av relevanta meiotiska fraktioner, inklusive alla stadier av meios, från könsceller till runda spermatider. När samlas in, kan dessa höganrikat meiotiska populationer kan användas för ett brett spektrum av analys. Detta protokoll beskriver dissociation av en vuxen testiklarna, volymerna kan anpassas för ungdomar eller för ytterligare testiklarna….

Discussion

Protokollet presenteras här gör att man samtidigt rena från vuxna hanmöss hela sortimentet av meiotiska scenen celler med mycket hög renhet, vilket gör utredare för att studera dynamiken i denna grundläggande process. Renat celler kan användas för många tillämpningar, från RNA-extraktion ^9,10, nukleosomen kartläggning ^11, rekombinanta molekylen upptäckt, analyser protein och många fler. Men detektionsmetoder måste anpassas till den mängd meiotiska renat celler. I och med hög repr…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Collagenase Type-1		Worthington	CLSS1	Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C
Trypsin		Worthington	TRL3	Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C
Hoechst 33342		Arcos	230001000	Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C
DNAse I		Sigma-Aldrich	DNEP	Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C
Gey’s Balance Salt Solution		Sigma-Aldrich	G9779
6″ Transfer Pipet		Fisher Scientific	137119D