Demonstrar os usos do Spectrometer Novel Força Gravitacional para esticar e Medida Proteínas fibrosas
Summary
Este é um passo-a-passo mostrando o objetivo, funcionamento e resultados representativos do espectrômetro de força gravitacional romance.
Abstract
O estudo da estrutura macromolecular tornou-se crítica para a elucidação dos mecanismos moleculares e função. Existem vários bio-instrumentos limitada, mas importante, capaz de testar a dependência força de características estruturais em proteínas. Escala tem sido um parâmetro limitante sobre a precisão pesquisadores podem perscrutar o mundo nanomechanical de moléculas, tais como ácidos nucléicos, enzimas e proteínas motoras que executam o trabalho de sustentação da vida. Microscopia de força atômica (AFM) é bem afinado para determinar estruturas de proteínas nativas fibroso com uma resolução distância a par com microscopia eletrônica. No entanto, em estudos AFM força, as forças são tipicamente muito maior do que uma única molécula poderá ter 1, 2. Armadilhas ópticas (OT) são muito bons em determinar a distância relativa entre as esferas de presos e que pode dar forças muito pequenas 3. No entanto, eles não rendem precisa comprimentos absoluta das moléculas em estudo. Simulações moleculares fornecem informações de suporte para tais experiências, mas são limitados na capacidade de lidar com os mesmos grandes tamanhos moleculares, prazos longos, e convencer alguns pesquisadores, na ausência de outras evidências 2, 4.
A força gravitacional espectrómetro (GFS) preenche um nicho importante no arsenal de um investigador, oferecendo uma combinação única de habilidades. Este instrumento é capaz de gerar forças tipicamente com 98% ou maior precisão do intervalo femtonewton à gama nanonewton. As medições de distância atualmente são capazes de resolver o comprimento absoluto molecular até cinco nanômetros, e relativa distâncias par talão de separação com uma precisão semelhante a uma armadilha óptica. Além disso, o GFS pode determinar alongamento ou desenrolando onde a força está perto de equilíbrio, ou fornecer uma força de classificados de justapor contra qualquer medida mudanças estruturais. É ainda possível determinar quantas resíduos de aminoácidos estão envolvidos em eventos desenrolando sob cargas fisiológicas força 2. Ao contrário de outros métodos onde há força de calibração extenso que deve preceder qualquer ensaio, o GFS não requer calibração tal força 5. Complementando os pontos fortes de outros métodos, o GFS vai colmatar as lacunas na compreensão do nanomecânica de proteínas vitais e de outras macromoléculas.
Protocol
Discussion
Ao converter um filme para uma representação digital thresholded, é crucial para a imagem thresholded para manter a mesma área em cada quadro do vídeo. Porque as contas em um par de esferas se movem independentemente um do outro, qualquer desvio nas áreas thresholded também pode causar as distâncias relativas entre os centróides das contas à deriva e introduzir erros significativos. Controlar a área limite reduzido o erro de cinco vezes nas medidas distância de 26 nm até 5 nm. Também é crucial para obter …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material é baseado num trabalho apoiado pela National Science Foundation, Grant No. 0842736.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Poly Sciences | 919-30-2 | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | ||
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110-86-1 | ||
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G7776 | ||
| Glycine | Research Organics | BP381-1 | ||
| Tris | Sigma | 9682T | ||
| Sodium azide | Amresco | 71289 | ||
| BSA | Sigma Aldrich | AMR-0332-100G | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | ||
| EDTA | MSI | E9884 | ||
| Nitrocellulose | Sigma | 60443 | ||
| N-N Dimethyl Formamide | Extracted from Large New | D4254 | ||
| Rabbit skeletal myosin II | Zealand White Rabbits (7-8) | NA | ||
| MF30 antibody (9-10) | Developmental Studies | MF30 | ||
| MF20 antibody (6) | Hybridoma Bank | MF20 | ||
| Lab microscope | Boreal | WW57905M00 | ||
| Equatorial mount | Celestron | CG-5 | ||
| Digital video cam | Sony | XCDV60 | ||
| Caliper release | Cabelas | IA-415482 | ||
| Compression spring | Jones Spring Co. | 723 | ||
| Extension spring | Jones Spring Co. | 770 | ||
| ImageJ | NIH | NA | ||
| Fire-i drivers & application | Unibrain | 3.80 | ||
| Excel | Microsoft | NA |
References
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