Demonstration der Verwendung des neuartigen Gravitationskraft Spectrometer auf Stretch and Measure Faserproteinen
Summary
Dies ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zeigt den Zweck, den Betrieb und repräsentative Ergebnisse aus dem Roman Gravitationskraft Spektrometer.
Abstract
Das Studium der makromolekularen Struktur hat sich kritisch zur Aufklärung der molekularen Mechanismen und Funktion. Es gibt mehrere begrenzte, aber wichtige Bioinstrumente der Lage, die Prüfung der Kraft Abhängigkeit der strukturellen Merkmale in Proteine. Skala hat eine Begrenzung der Parameter, wie genau können die Forscher in den nanomechanischen Welt der Moleküle, wie Nukleinsäuren, Enzymen und Motor-Proteine, die lebenserhaltende Arbeit zu verrichten Peer worden. Atomic Force Microscopy (AFM) ist gut abgestimmt, um einheimische Strukturen Faserproteinen mit einem Abstand Auflösung auf Augenhöhe mit der Elektronenmikroskopie bestimmen. Doch in AFM-Studien sind die Kräfte in der Regel viel höher als ein einzelnes Molekül kann 1, 2 zu erleben. Optische Fallen (OT) sind sehr gut auf die Bestimmung der relative Abstand zwischen den eingeschlossenen Perlen, und sie verleihen können sehr kleine Forces 3. Allerdings stehen sie nicht nachgeben genaue absolute Länge der Moleküle unter-Studie. Molekulare Simulationen liefern unterstützende Informationen für solche Experimente, sondern in der Fähigkeit, die gleichen großen molekularen Größen, lange Zeiträume, Griff und überzeugen einige Forscher in Ermangelung anderer Belege 2, 4 begrenzt.
Die Gravitationskraft Spektrometer (GFS) füllt eine kritische Nische in das Arsenal der Ermittler durch eine einzigartige Kombination von Fähigkeiten. Dieses Instrument ist in der Lage Kräfte in der Regel mit 98% oder eine höhere Genauigkeit bei der femtonewton Bereich der Nanonewton Bereich. Die Abstandsmessungen derzeit sind in der Lage die Lösung der absolute molekulare Länge bis fünf Nanometer, und die relative bead Paar Abstände mit einer Genauigkeit vergleichbar mit einer optischen Falle. Außerdem kann die GFS bestimmen Dehnung oder Abwickeln, wo die Kraft der Nähe des Gleichgewichts ist, oder eine abgestufte Kraft gegen jede gemessene strukturelle Veränderungen gegenüberzustellen. Es ist sogar möglich, festzustellen, wie viele Aminosäuren sind in Abwickeln Veranstaltungen unter physiologischen Kraftbelastungen 2 beteiligt. Im Gegensatz zu anderen Methoden, wo es umfangreiche Kraftkalibrierung, dass alle Tests vorausgehen muss, erfordert die GFS keine solche Kraft Kalibrierung 5. Durch die Ergänzung der Stärken des anderen Methoden wird die GFS Lücken im Verständnis der Nanomechanik lebenswichtiger Proteine und andere Makromoleküle zu überbrücken.
Protocol
Discussion
Bei der Konvertierung eines Films auf einem digital Schwellenwert Darstellung, ist es entscheidend für den Schwellenwert Bild, um die gleiche Fläche in jedem Frame des Videos zu erhalten. Da die Kügelchen in eine Perle Paar unabhängig voneinander bewegen, kann eine Drift in den Schwellenwert Bereichen auch dazu führen, die relativen Abstände zwischen den Schwerpunkten der Perlen zu treiben und führen zu signifikanten Fehler. Controlling der Schwelle Bereich reduziert den Fehler das Fünffache in die Abstandsmessu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Material ist auf der Arbeit von der National Science Foundation unter Grant No 0842736 unterstützt werden.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Poly Sciences | 919-30-2 | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | ||
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110-86-1 | ||
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G7776 | ||
| Glycine | Research Organics | BP381-1 | ||
| Tris | Sigma | 9682T | ||
| Sodium azide | Amresco | 71289 | ||
| BSA | Sigma Aldrich | AMR-0332-100G | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | ||
| EDTA | MSI | E9884 | ||
| Nitrocellulose | Sigma | 60443 | ||
| N-N Dimethyl Formamide | Extracted from Large New | D4254 | ||
| Rabbit skeletal myosin II | Zealand White Rabbits (7-8) | NA | ||
| MF30 antibody (9-10) | Developmental Studies | MF30 | ||
| MF20 antibody (6) | Hybridoma Bank | MF20 | ||
| Lab microscope | Boreal | WW57905M00 | ||
| Equatorial mount | Celestron | CG-5 | ||
| Digital video cam | Sony | XCDV60 | ||
| Caliper release | Cabelas | IA-415482 | ||
| Compression spring | Jones Spring Co. | 723 | ||
| Extension spring | Jones Spring Co. | 770 | ||
| ImageJ | NIH | NA | ||
| Fire-i drivers & application | Unibrain | 3.80 | ||
| Excel | Microsoft | NA |
References
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