Dimostrare l'Usi del romanzo Spectrometer forza gravitazionale su Stretch e misura proteine fibrose
Summary
Questo è un passo-passo guida che mostra la finalità, il funzionamento ei risultati rappresentante del spettrometro romanzo forza gravitazionale.
Abstract
Lo studio della struttura macromolecolare è diventato fondamentale per il chiarimento dei meccanismi molecolari e funzione. Ci sono diversi bioinstruments limitato, ma importante, in grado di testare la dipendenza forza delle caratteristiche strutturali di proteine. Scala è stata un parametro che limita la quantità accuratamente i ricercatori possono scrutare il mondo nanomeccaniche di molecole, come gli acidi nucleici, enzimi e proteine motrici che eseguono sostiene la vita di lavoro. Microscopia a forza atomica (AFM) è ben sintonizzato per determinare le strutture native delle proteine fibrose con una risoluzione distanza alla pari con microscopia elettronica. Tuttavia, in studi AFM vigore, le forze sono in genere molto più alto di una singola molecola che si verifichino 1, 2. Trappole ottiche (OT) sono molto bravi a determinare la distanza relativa tra le perle intrappolati e possono impartire piccole forze 3. Tuttavia, essi non producono accurata lunghezze assolute delle molecole oggetto di studio. Simulazione molecolare fornire informazioni di supporto a tali esperimenti, ma sono limitate nella capacità di gestire le stesse grandi dimensioni molecolari, tempi lunghi, e convincere alcuni ricercatori, in assenza di altre prove 2, 4.
La forza gravitazionale spettrometro (GFS), riempie una nicchia critico nell'arsenale di un investigatore, fornendo una combinazione unica di capacità. Questo strumento è in grado di generare forze di solito con il 98% o maggiore precisione della gamma femtonewton alla gamma nanonewton. Le misure di distanza attualmente sono in grado di risolvere la lunghezza assoluta molecolare fino a cinque nanometri, e relative distanze di perline paio di separazione con una precisione simile a una trappola ottica. Inoltre, il GFS può determinare stretching o srotolare in cui la forza è vicino all'equilibrio o fornire una forza graduata a giustapporre contro qualsiasi cambiamento strutturale misurata. E 'anche possibile determinare il numero di residui di aminoacidi sono coinvolti in eventi di srotolare sotto carichi fisiologici forza 2. A differenza di altri metodi dove si trova la forza di calibrazione estesa che deve precedere qualsiasi test, il GFS non richiede alcuna calibrazione tale forza 5. Integrando i punti di forza di altri metodi, il GFS colmerà le lacune nella comprensione dei nanomeccanica delle proteine vitali e di altre macromolecole.
Protocol
Discussion
Durante la conversione di un filmato a una rappresentazione digitale thresholded, è fondamentale per l'immagine thresholded a mantenere la stessa area in ogni fotogramma del video. Perché le perle di una coppia cordone si muovono indipendentemente l'uno dall'altro, la sua deriva nelle aree thresholded può anche causare le distanze relative tra i centroidi delle perline alla deriva e introdurre errori significativi. Il controllo della zona ha ridotto la soglia di errore di cinque volte nelle misure da 26 n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo materiale si basa su un lavoro sostenuto dal National Science Foundation sotto Grant No. 0842736.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Poly Sciences | 919-30-2 | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | ||
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110-86-1 | ||
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G7776 | ||
| Glycine | Research Organics | BP381-1 | ||
| Tris | Sigma | 9682T | ||
| Sodium azide | Amresco | 71289 | ||
| BSA | Sigma Aldrich | AMR-0332-100G | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | ||
| EDTA | MSI | E9884 | ||
| Nitrocellulose | Sigma | 60443 | ||
| N-N Dimethyl Formamide | Extracted from Large New | D4254 | ||
| Rabbit skeletal myosin II | Zealand White Rabbits (7-8) | NA | ||
| MF30 antibody (9-10) | Developmental Studies | MF30 | ||
| MF20 antibody (6) | Hybridoma Bank | MF20 | ||
| Lab microscope | Boreal | WW57905M00 | ||
| Equatorial mount | Celestron | CG-5 | ||
| Digital video cam | Sony | XCDV60 | ||
| Caliper release | Cabelas | IA-415482 | ||
| Compression spring | Jones Spring Co. | 723 | ||
| Extension spring | Jones Spring Co. | 770 | ||
| ImageJ | NIH | NA | ||
| Fire-i drivers & application | Unibrain | 3.80 | ||
| Excel | Microsoft | NA |
References
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