Démonstration des utilisations du spectromètre force gravitationnelle roman de s'étirer et de mesurer les protéines fibreuses

Summary

Ceci est une étape-par étape indiquant l'objet, l'exploitation et des résultats représentatifs du spectromètre force gravitationnelle roman.

Abstract

L'étude de la structure macromoléculaire est devenue critique à l'élucidation des mécanismes moléculaires et de la fonction. Il ya plusieurs BioInstruments limité, mais important, capable de tester la dépendance vigueur de caractéristiques structurelles de protéines. Échelle a été un paramètre limitant de la précision avec les chercheurs peuvent les pairs dans le monde nanomécaniques de molécules, comme les acides nucléiques, enzymes et protéines motrices qui assurent maintien de la vie de travail. La microscopie à force atomique (AFM) est bien réglé pour déterminer les structures des protéines fibreuses natif avec une résolution de distance à égalité avec la microscopie électronique. Toutefois, dans les études de la force AFM, les forces sont généralement beaucoup plus élevé que une seule molécule pourrait l'expérience ^{1, 2.} Pièges optiques (OT) sont très bons à la détermination de la distance relative entre les billes piégées et qu'elles peuvent transmettre des forces très petit ^3. Cependant, ils ne donnent pas de précision longueurs absolues des molécules à l'étude. Simulations moléculaires fournissent des informations favorables à de telles expériences, mais ils sont limités dans la capacité à gérer les mêmes grandes tailles moléculaires, de longues périodes, et convaincre certains chercheurs en l'absence de preuves à l'appui d'autres ^{2, 4.}

La force gravitationnelle spectromètre (SFG) remplit un créneau essentiel dans l'arsenal d'un enquêteur en offrant une combinaison unique de capacités. Cet instrument est capable de générer des forces en général, avec 98% ou plus de précision de la gamme à la gamme femtonewton nanonewton. Les mesures de distance sont actuellement capables de résoudre la longueur moléculaire absolue à cinq nanomètres, et relative perles distances de séparation paire avec une précision semblable à un piège optique. En outre, le SFP peut déterminer étirement ou dévidage où la force est à proximité de l'équilibre, ou de fournir une force graduée de juxtaposer contre toute modification structurelle mesurée. Il est même possible de déterminer combien de résidus d'acides aminés sont impliqués dans des événements dérouler sous une force physiologique ^2. Contrairement à d'autres méthodes où il ya l'étalonnage vigueur vaste qui doit précéder toute épreuve, le SFP nécessite pas de calibration telle force ^5. En complétant les forces d'autres méthodes, le GFS combler les lacunes dans la compréhension de la nanomécanique de protéines essentielles et d'autres macromolécules.

Protocol

Introduction à la nouvelle configuration GFS La SFP est constitué de plusieurs éléments essentiels: un microscope à lumière régulière, une monture équatoriale, une caméra et un ordinateur [Figure 1]. Les scellés de flux des cellules de chambre qui détient l'échantillon est également indispensable en fonction de la conception des SFP. Le microscope optique est monté sur la monture équatoriale de sorte que le champ peut être tourné dans différentes orientations dans l'…

Discussion

Lors de la conversion d'un film à une représentation numérique seuillée, il est crucial pour l'image seuillée pour maintenir la même région, dans chaque image de la vidéo. Parce que les perles dans une paire de billes se déplacent indépendamment les uns des autres, toute dérive dans les zones seuillée peuvent aussi causer les distances relatives entre les centroïdes des perles à la dérive et d'introduire des erreurs significatives. Contrôle de la zone seuil réduit l'erreur de cinq fois d…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
3-Aminopropyltriethoxysilane		Poly Sciences	919-30-2
Acetone		Fisher Scientific	A18P-4
Pyridine		Sigma Aldrich	110-86-1
Glutaraldehyde		Fisher Scientific	G7776
Glycine		Research Organics	BP381-1
Tris		Sigma	9682T
Sodium azide		Amresco	71289
BSA		Sigma Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl		Sigma	S7653
EDTA		MSI	E9884
Nitrocellulose		Sigma	60443
N-N Dimethyl Formamide		Extracted from Large New	D4254
Rabbit skeletal myosin II		Zealand White Rabbits (7-8)	NA
MF30 antibody (9-10)		Developmental Studies	MF30
MF20 antibody (6)		Hybridoma Bank	MF20
Lab microscope		Boreal	WW57905M00
Equatorial mount		Celestron	CG-5
Digital video cam		Sony	XCDV60
Caliper release		Cabelas	IA-415482
Compression spring		Jones Spring Co.	723
Extension spring		Jones Spring Co.	770
ImageJ		NIH	NA
Fire-i drivers & application		Unibrain	3.80
Excel		Microsoft	NA