Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot
Summary
Bu teknik makale Invitrogen gelen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez Mini Jel sistemi kullanarak standart bir western-blot prosedürü açıklamaktadır.
Abstract
Western Blot (veya immün) araştırmacılar, bir proteinin ifade doğrulamak için izin veren bir standart laboratuvar prosedürü, farklı örnekleri protein mevcut bağıl miktarını belirlemek ve co-immunoprecipitation deneylerin sonuçlarını analiz. Bu yöntemde, bir hedef protein, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek belirli bir birincil antikor ile tespit edilir. SDS-PAGE denatüre kullanarak molekül ağırlığına göre protein ayırma sağlanır. Bir zar transferinden sonra, hedef protein belirli bir primer antikor ile probed ve kemilüminesans tarafından algılanır.
Western-blot tekniği ilk açıklamasını bu yana, prekast jeller ve kullanıcı dostu donanımları dahil olmak üzere çeşitli gelişmeler, uğramıştır. Laboratuvarımızda, Invitrogen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez sistemi kullanmayı tercih var. Bu yenilikçi bir nötr pH, süreksiz SDS-PAGE, prekast mini-jel sistem. 8 ay ile 1 yıl arasında değişen pre-cast jeller daha uzun bir raf ömrü i) ii) 1 ile 400 kDa molekül ağırlıkları geniş bir ayırma aralığı türüne bağlı olarak: Bu sistem de dahil olmak üzere, geleneksel Laemmli tekniği üzerinde birçok avantaj sunar jel kullanılır;) ve iii çok yönlülük (akrilamid yüzdesi, jel tipi ve çalışan tamponun iyonik bileşimi aralık).
Bu video makalede açıklanan prosedür Invitrogen NuPAGE elektroforez sistemi kullanarak bir western-blot gerçekleştirmek için nasıl bir örnek olarak,% 4-12 Bis-Tris degrade jeller ve MES tampon çalışan Bis-Tris süreksiz tampon sistemi kullanır. Laboratuvarımızda, biz bu batı-blot yöntemi kullanılarak çeşitli biyokimyasal uygulamalar için iyi ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmiştir.
Protocol
Discussion
Burada sunulan prosedür MES denatüre SAYFA Invitrogen NuPAGE Novex elektroforez sistemi kullanarak bir örnek olarak tampon çalışan bir Bis-Tris jel kullanıyor. Buna ek olarak, bu prekast jel sistemi denatüre veya non-denatüre koşullarının yanı sıra altında protein ayrılmasına izin molekül ağırlıkları geniş bir yelpazede (1-200 kDa Bis-Tris jeller için 36-400 kDa Tris-uygun Asetat jeller). Denemenizi bağlı olarak, burada açıklanan batı blot tekniği sadece bir bölümünü doğrudan jel boyama işlemleri (örneğ…
Acknowledgements
References
- . Gel Migration chart: . , .
- . Complete western-blot protocol from the Invitrogen website. , .
- . NuPAGE technical guide. , .
- . Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell. , .
- . ECL Plus Western blotting detection reagents instruction. , .
- . Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website. , .
- Yeromin, A. V., et al. Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai. Nature. 443, 226-229 (2006).
- Zhang, S. L., et al. Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3. J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).
- Penna, , et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. , .
