الغربية التنشيف باستخدام NuPage Invitrogen Novex مكرر تريس MiniGels
Summary
هذا المقال يصف التقنية القياسية الغربي النشاف الإجراء باستخدام الكهربائي NuPAGE المتاحة تجاريا مصغرة جل النظام من Invitrogen.
Abstract
التنشيف الغربي (أو immunoblotting) هو إجراء المختبر القياسية السماح للمحققين للتحقق من التعبير عن بروتين ، وتحديد القيمة النسبية للحاضر البروتين في عينات مختلفة ، وتحليل نتائج التجارب المشتركة مناعي. في هذا الأسلوب ، يتم الكشف عن بروتين الهدف مع الأضداد ابتدائية معينة في عينة معينة من جناسة الأنسجة أو استخراج. ويتحقق وفقا لفصل البروتين الوزن الجزيئي باستخدام تغيير طبيعة SDS – PAGE. بعد نقلها إلى غشاء ، هو بحث البروتين الهدف مع الأضداد ابتدائية معينة والكشف عنها بواسطة لمعان كيميائي.
منذ الوصف الأول ، وقد مرت هذه التقنية الغربي النشاف العديد من التحسينات ، بما في ذلك المواد الهلامية مسبقة الصنع ومعدات صديقة للمستخدم. في مختبرنا ، اخترنا لاستخدام الكهربائي NuPAGE المتاحة تجاريا من نظام Invitrogen. وهو الرقم الهيدروجيني المبتكرة محايدة ، متقطع SDS – PAGE ، مسبقة الصنع مصغرة هلام النظام. هذا النظام يقدم العديد من المزايا التقنية Laemmli التقليدية بما في ذلك : أ) حياة أطول الجرف من المواد الهلامية مسبقة الصنع تتراوح بين 8 أشهر إلى سنة 1 ؛ الثاني) فصل مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية 1-400 كيلو دالتون تبعا لنوع من الجل المستخدمة ؛ والثالث) وزيادة التنوع (مجموعة من نسبة مادة الأكريلاميد ، ونوع من الهلام ، وتركيبة الأيونية للالعازلة على التوالي).
الإجراء الموضح في هذه المقالة الفيديو يستخدم نظام مكرر تريس العازلة المتقطعة مع 4-12 ٪ مكرر تريس التدرج المواد الهلامية وزارة التربية والعلم تشغيل العازلة ، وكمثال على كيفية تنفيذ وصمة عار للغرب باستخدام الكهربائي NuPAGE Invitrogen النظام. في المختبر لدينا ، لقد حصلنا على نتائج جيدة وقابلة للتكرار للتطبيقات الحيوية المختلفة باستخدام هذا الأسلوب الغربي النشاف.
Protocol
Discussion
الإجراء المعروض هنا يستخدم الجل مكرر تريس مع MES تشغيل العازلة كمثال على تغيير طبيعة الصفحة باستخدام الكهربائي Invitrogen Novex NuPAGE النظام. بالإضافة إلى ذلك ، هذا النظام هلام مسبقة الصنع يسمح فصل البروتين تحت تغيير طبيعة أو عدم تغيير طبيعة الظروف ، وكذلك يستوعب مجموعة واسعة من الأوزان ا…
Acknowledgements
References
- . Gel Migration chart: . , .
- . Complete western-blot protocol from the Invitrogen website. , .
- . NuPAGE technical guide. , .
- . Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell. , .
- . ECL Plus Western blotting detection reagents instruction. , .
- . Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website. , .
- Yeromin, A. V., et al. Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai. Nature. 443, 226-229 (2006).
- Zhang, S. L., et al. Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3. J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).
- Penna, , et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. , .
