Western blot en utilisant l'Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels
Summary
Cet article technique décrit un standard occidental buvard procédure en utilisant l'électrophorèse commercialement disponibles NuPAGE Mini-Gel du système d'Invitrogen.
Abstract
Western Blot (ou immuno-) est une procédure standard de laboratoire permettant aux enquêteurs de vérifier l'expression d'une protéine, de déterminer la quantité relative de la protéine présente dans les différents échantillons, et d'analyser les résultats des expériences de co-immunoprécipitation. Dans cette méthode, une protéine cible est détectée avec un anticorps primaire spécifique dans un échantillon donné d'homogénat de tissu ou de l'extrait. Séparation des protéines selon leur poids moléculaire est réalisé en utilisant dénaturant SDS-PAGE. Après transfert sur une membrane, la protéine cible est sondée avec un anticorps spécifique primaire et détecté par chimioluminescence.
Depuis sa première description, la technique de western-blot a subi plusieurs améliorations, dont préfabriqués gels et conviviale de l'équipement. Dans notre laboratoire, nous avons choisi d'utiliser le système NuPAGE commercialement disponible chez Invitrogen électrophorèse. Il s'agit d'un pH neutre, innovant, discontinue SDS-PAGE, préfabriqués mini-système de gel. Ce système présente plusieurs avantages par rapport à la technique traditionnelle de Laemmli notamment: i) une durée de conservation des gels préfabriqués allant de 8 mois à 1 an; ii) une gamme de séparation éventail de poids moléculaires de 1 à 400 kDa selon le type du gel utilisé, et iii) une plus grande polyvalence (gamme de pourcentage d'acrylamide, le type de gel, et la composition ionique du tampon d'exécution).
La procédure décrite dans cet article la vidéo utilise le système de tampon Bis-Tris discontinue avec 4-12% de Bis-Tris gels de gradient et MES courir tampon, comme une illustration de la façon d'effectuer un test western blot-en utilisant le système d'Invitrogen électrophorèse NuPAGE. Dans notre laboratoire, nous avons obtenu de bons résultats et reproductible pour diverses applications biochimiques en utilisant cette méthode western-blot.
Protocol
Discussion
La procédure présentée ici utilise un gel de Bis-Tris avec MES Tampon comme un exemple de dénaturation PAGE en utilisant le système d'Invitrogen NuPAGE électrophorèse Novex. En outre, ce système de pré-gel permet la séparation des protéines fonte sous dénaturation ou conditions non dénaturantes ainsi que peut accueillir une large gamme de poids moléculaire (1 à 200 kDa pour les gels Bis-Tris à 36-400 kDa pour le Tris- des gels d'acétate). Selon votre expérience, vous pouvez choisir de suivre une partie seulement de…
Acknowledgements
References
- . Gel Migration chart: . , .
- . Complete western-blot protocol from the Invitrogen website. , .
- . NuPAGE technical guide. , .
- . Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell. , .
- . ECL Plus Western blotting detection reagents instruction. , .
- . Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website. , .
- Yeromin, A. V., et al. Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai. Nature. 443, 226-229 (2006).
- Zhang, S. L., et al. Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3. J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).
- Penna, , et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. , .
