המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels
Summary
מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג'ל המערכת Invitrogen.
Abstract
המערבי סופג (או immunoblotting) הוא הליך סטנדרטי המאפשר לחוקרים מעבדה כדי לאמת את הביטוי של חלבון, לקבוע את כמות יחסית של ההווה חלבון בדגימות שונות, לנתח את התוצאות של שיתוף immunoprecipitation ניסויים. בשיטה זו, חלבון מטרה מזוהה עם נוגדן ראשוני ספציפי במדגם נתון homogenate רקמה או לחלץ. הפרדת חלבונים על פי משקל מולקולרי מושגת באמצעות denaturing SDS-PAGE. לאחר העברת קרום, חלבון המטרה היא חקרה עם נוגדן ראשוני ספציפי זוהה על ידי chemiluminescence.
מאז התיאור הראשון שלה, את הטכניקה המערבי סופג עבר מספר שיפורים, כולל מראש יצוק ג'ל ידידותי למשתמש הציוד. במעבדה שלנו, בחרנו להשתמש אלקטרופורזה זמינים מסחרית מערכת NuPAGE מן Invitrogen. זהו ה-pH נייטרלי חדשניים, רציפה SDS-PAGE, טרום יצוק מיני ג'ל המערכת. מערכת זו מציגה מספר יתרונות על פני השיטה המסורתית Laemmli כולל: א) חיי מדף ארוכים יותר של טרום יצוק ג'לים החל 8 חודשים עד שנה 1; ii) הפרדה מגוון רחב של משקלים מולקולריים 1-400 kDa בהתאם לסוג ג'ל המשמש וכן iii) רבגוניות גדולה יותר (בטווח של אחוז acrylamide, סוג של ג'ל, והרכב יוניים של למאגר ריצה).
ההליך המתואר במאמר זה וידאו מנצל את מערכת Bis-טריס חיץ רציפה עם 4-12% Bis-טריס צבע ג'ל MES ריצה חיץ, כמו איור של כיצד לבצע כתם המערבי באמצעות מערכת אלקטרופורזה Invitrogen NuPAGE. במעבדה שלנו, השגנו תוצאות טובות לשעתקו עבור יישומים ביוכימיים שונים בשיטה זו המערבי סופג.
Protocol
Discussion
הנוהל המובא כאן משתמשת ביס, טריס ג'ל עם MES ריצה חיץ כדוגמה denaturing הדף באמצעות NuPAGE Invitrogen מערכת Novex אלקטרופורזה. בנוסף, מערכת זו מראש יצוק הג'ל מאפשר הפרדה חלבון תחת denaturing או לא denaturing תנאים כמו גם להכיל מגוון רחב של משקלים מולקולריים (1-200 kDa עבור הג'לים Bis-טריס 36-400 kDa עבור טריס- Acetate…
Acknowledgements
References
- . Gel Migration chart: . , .
- . Complete western-blot protocol from the Invitrogen website. , .
- . NuPAGE technical guide. , .
- . Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell. , .
- . ECL Plus Western blotting detection reagents instruction. , .
- . Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website. , .
- Yeromin, A. V., et al. Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai. Nature. 443, 226-229 (2006).
- Zhang, S. L., et al. Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3. J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).
- Penna, , et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. , .
