双分子荧光互补
Summary
在确定的时空调控细胞信号蛋白质的亚细胞定位是很重要的。在这里，我们描述了一个简单的方法监测在细胞内的蛋白质的空间相互作用的双分子荧光互补（附设）。
Abstract
定义必须了解复杂的输出信号复合物的亚细胞分布。 常规方法，如免疫复合物的空间定位的信息不提供。相比之下，附设显示器的相互作用和细胞内的蛋白质复合物的条块分割。在此方法中，fluororescent蛋白质氨基和羧基端的非荧光片段，这两种蛋白质的利益，然后融合到分成。重组的荧光（图1）1,2的蛋白质结果的相互作用。附设的一个限制是，一旦重组分散的荧光基团是复杂的，是不可逆转的 3 。这种限制是在检测的瞬态或弱相互作用是有利的，但排除了复杂的动态的动力学分析。另外一个需要注意的是，重组后的flourophore需要30分钟，以成熟和荧光，再次解除观察实时交互4。附设的蛋白质片段互补法（PCA）的记者的蛋白质，如绿色荧光蛋白变异（附设），二氢叶酸还原酶，B -内酰胺酶和荧光素酶蛋白质员工具体的例子： 蛋白质相互作用5,6。替代的方法来研究蛋白质在细胞中的蛋白质相互作用，包括荧光共定位和福斯特共振能量转移（FRET）7 。合作的定位，两种蛋白质单独标签可以直接与间接免疫荧光基团或。然而，这种做法导致高背景的非相互作用的蛋白质，使其难以解释的合作本地化数据。此外，由于共聚焦显微镜分辨率的限制，两种蛋白质，可能会出现，而不必进行交互合作本地化。随着附设，荧光观察时，两种蛋白相互作用的利益。 FRET的是另一种优秀的方法研究蛋白质：蛋白质相互作用，但可以在技术上具有挑战性。 FRET实验要求供体和受体类似的亮度和在细胞内的化学计量。此外，必须考虑到受体通道，反之亦然通过捐助为出血。附设有不同的FRET，荧光图像数据的小背景，小的后处理，不需要很高的过度表达，并可以检测弱或短暂的相互作用。生物发光共振能量转移（BRET）是一个类似的担忧，除了捐助是一种酶（如荧光素酶）催化底物，从而令人兴奋的一个受体，成为发光的方法。 BRET没有流血通过技术问题和高背景荧光，但没有能力提供的空间信息，由于缺乏基板本地化的8个具体的车厢。总体而言，附设是一个可视化的蛋白质复合体的亚细胞定位要进入隔离的信号洞察力的优秀方法。
Protocol
Discussion
附设是优秀的可视化蛋白质的方法：在整个细胞中的蛋白质相互作用，并确定这些复合物的亚细胞定位。附设的优势，只有相互作用的蛋白质荧光，相互作用的瞬态稳定，成像数据的后处理是最小的。这种方法的缺点是复杂的荧光团的荧光和不可逆转的成熟时间。在一些应用程序可以使用这个不可逆转的优势。例如，一个可使用附设复杂的酶，酶的活化剂，导致构激活。然后确定哪些蛋白质招募?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ITSN，PI3K的C2β，并在本议定书中所使用的控制向量都可以从作者的请求后，仅用于非商业目的。作者要感谢张博士邓小平胡锦涛请提供意见和建立在O'Bryan实验室附设协议中所用的试剂。卡乌是从基金会杰罗姆勒琼的资金支持。在O'Bryan实验室的工作是由美国国立卫生研究院（HL090651），国防部（PR080428），圣Baldrick的基金会，基金会杰罗姆勒琼的赠款支持。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-013 | ||
| Fetal bovine serum | Cellgro | 35-011-CV | ||
| Glass Bottom Microwell dishes | Matek | P35G-1.5-14C | ||
| 6-well dishes | Falcon | 35-3846 | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 18324020 | ||
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | ||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 META |
References
- Kerppola, T. K. Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40, 61-66 (2006).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies. Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).
- Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA). Methods. 40, 287-293 (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).
- Martin, N. P. Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling. Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).
- Das, M. Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3′-kinase C2beta-AKT pathway. Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).
- Mohney, R. P. Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving. JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).
- Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O’Bryan, J. P., McPherson, P. S. Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis. J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).
- Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O’Bryan, J. P. Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways. J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).
- O’Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. Mitogenesis and endocytosis: What’s at the INTERSECTIoN?. Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).
