Bimolecolari complementazione fluorescenza
Summary
La localizzazione subcellulare delle proteine è importante nel determinare la regolazione spazio-temporale di segnalazione cellulare. Qui, descriviamo biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) come un metodo semplice per il monitoraggio delle interazioni spaziali delle proteine all'interno della cellula.
Abstract
Definire la distribuzione subcellulare di complessi di segnalazione è fondamentale per comprendere l'output di quel complesso. Metodi convenzionali come immunoprecipitazione non forniscono informazioni sulla localizzazione spaziale dei complessi. Al contrario, BiFC controlla l'interazione e la compartimentazione subcellulare di complessi proteici. In questo metodo, una proteina fluororescent è suddivisa in amino-e carbossi-terminale non fluorescente frammenti che vengono poi fuse per due proteine di interesse. Interazione dei risultati proteine ricostituzione del fluoroforo (Figura 1) 1,2. Una limitazione di BiFC è che una volta che il fluoroforo frammentato è ricostituito il complesso è irreversibile 3. Questa limitazione è vantaggioso nel rilevare interazioni transitoria o deboli, ma esclude l'analisi cinetica di dinamiche complesse. Un ulteriore avvertimento è che il flourophore ricostituito richiede 30 minuti di maturare e di fluorescenza, di nuovo precludendo l'osservazione di interazioni in tempo reale 4. BiFC è un esempio specifico del test di complementazione proteica frammento (PCA), che impiega proteine giornalista come varianti proteina fluorescente verde (BiFC), la diidrofolato reduttasi, b-lattamasi, e luciferasi per misurare le proteine: interazioni proteina 5,6. Metodi alternativi per lo studio delle proteine: interazioni proteina nelle cellule includono fluorescenza co-localizzazione e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) 7. Per la co-localizzazione, due proteine sono contrassegnati individualmente o direttamente con un fluoroforo o mediante immunofluorescenza indiretta. Tuttavia, questo approccio porta a di fondo di non interagenti proteine che lo rende difficile da interpretare co-localizzazione dei dati. Inoltre, a causa dei limiti di risoluzione della microscopia confocale, due proteine possono apparire co-localizzati senza necessariamente interagire. Con BiFC, fluorescenza è osservato solo quando le due proteine di interesse interagire. FRET è un altro ottimo metodo per lo studio delle proteine: interazioni delle proteine, ma possono essere tecnicamente difficile. FRET esperimenti richiedono il donatore e accettore di essere di luminosità simili e stechiometria nella cella. Inoltre, si deve tenere conto di sanguinare tramite del donatore nel canale accettore e viceversa. A differenza di FRET, BiFC ha poco fluorescenza di fondo, poco dopo l'elaborazione dei dati di immagine, non richiede l'iperespressione alto, e in grado di rilevare le interazioni deboli o transitorie. Risonanza trasferimento bioluminescenza energia (BRET) è un metodo simile a FRET tranne il donatore è un enzima (luciferasi ad esempio) che catalizza un substrato per diventare bioluminescenti così emozionante un accettore. BRET mancano i problemi tecnici di sanguinare attraverso e fluorescenza di fondo alto, ma manca la capacità di fornire informazioni spaziali a causa della mancanza di localizzazione del substrato ai compartimenti specifici 8. Nel complesso, BiFC è un metodo eccellente per la visualizzazione di localizzazione subcellulare di complessi proteici al fine di conoscere segnalazione compartimenti stagni.
Protocol
Discussion
BiFC è un metodo eccellente per la visualizzazione di proteine: interazioni proteina nelle cellule intere e determinare la localizzazione subcellulare di questi complessi. I vantaggi di BiFC sono solo le proteine che interagiscono sono fluorescenti, le interazioni transitorie sono stabilizzate, e post-processing dei dati di imaging è minimo. Due gli svantaggi di questo metodo sono il tempo di maturazione per l'fluoroforo e l'irreversibilità del complesso fluoroforo. In alcune applicazioni di questa irre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il ITSN, PI3K-C2β, e vettori di controllo utilizzati in questo protocollo sono disponibili presso gli autori, su richiesta, per scopi non commerciali solo. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Chang-Deng Hu per la gentile consulenza e dei reagenti utilizzati per stabilire il protocollo BiFC in laboratorio O'Bryan. KAW è stata sostenuta da un finanziamento della Fondazione Jerome Lejeune. Lavoro in laboratorio O'Bryan è sostenuto da finanziamenti della (HL090651) NIH, DOD (PR080428), la Fondazione San Baldrick, e la Fondazione Jerome Lejeune.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-013 | ||
| Fetal bovine serum | Cellgro | 35-011-CV | ||
| Glass Bottom Microwell dishes | Matek | P35G-1.5-14C | ||
| 6-well dishes | Falcon | 35-3846 | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 18324020 | ||
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | ||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 META |
References
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