Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie
Summary
De subcellulaire lokalisatie van eiwitten is belangrijk bij het bepalen van de spatio-temporele regulatie van cell signaling. We beschrijven hier bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) als een eenvoudige methode voor het bewaken van de ruimtelijke interacties van eiwitten in de cel.
Abstract
Het definiëren van de subcellulaire distributie van signalering complexen is absoluut noodzakelijk om het begrijpen van de uitvoer van dat complex. Conventionele methoden zoals immunoprecipitatie geen informatie geven over de ruimtelijke lokalisatie van complexen. In tegenstelling, BiFC controleert de interactie en subcellulaire compartimentering van eiwitcomplexen. In deze methode wordt een fluororescent eiwit te splitsen in amino-en carboxy-terminale niet-fluorescerende fragmenten die vervolgens worden gefuseerd met twee eiwitten van belang. Interactie van de eiwitten resulteert in een reconstructie van de fluorofoor (Figuur 1) 1,2. Een beperking van BiFC is dat zodra de gefragmenteerde fluorofoor is gereconstitueerd het complex is onomkeerbaar 3. Deze beperking is voordelig bij het opsporen van voorbijgaande of zwakke interacties, maar verzet zich tegen een kinetische analyse van complexe dynamiek. Een bijkomend nadeel is dat het opgeloste flourophore vereist 30min om te rijpen en fluoresceren, opnieuw verzet tegen de observatie van real-time interactie 4. BiFC is een specifiek voorbeeld van het eiwit fragment invulling assay (PCA), die reporter eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit varianten (BiFC), dihydrofolaatreductase, b-lactamase, en luciferase om eiwitten te meten telt: eiwit interacties 5,6. Alternatieve methoden voor eiwit bestuderen: eiwit interacties in cellen op te nemen fluorescentie co-localisatie en Förster resonance energy transfer (FRET) 7. Voor co-localisatie, zijn twee eiwitten individueel, hetzij direct gelabeld met een fluorofoor of door indirecte immunofluorescentie. Echter, deze benadering leidt tot een hoge achtergrond van niet-interagerende eiwitten waardoor het moeilijk is om co-localisatie gegevens te interpreteren. Daarnaast is te wijten aan de grenzen van de resolutie van confocale microscopie, kan twee eiwitten lijken co-gelokaliseerde zonder dat interactie. Met BiFC, wordt fluorescentie alleen waargenomen wanneer de twee eiwitten van belang met elkaar omgaan. FRET is een uitstekende methode voor het bestuderen eiwit: eiwit interacties, maar kan technisch gezien een uitdaging. FRET experimenten vereisen de donor en acceptor te worden van dezelfde helderheid en stoichiometrie in de cel. Bovendien moet een account voor bloeden door van de donor naar de acceptor kanaal en vice versa. FRET in tegenstelling tot, BiFC heeft weinig achtergrond fluorescentie, paaltje verwerking van de beeldgegevens, vereist geen hoge overexpressie, en kan detecteren zwakke of voorbijgaande interacties. Bioluminescentie resonantie energie-overdracht (BRET) is een methode lijkt op FRET, behalve de donor is een enzym (bijv. luciferase) dat een substraat katalyseert te worden bioluminescente zo spannend een acceptor. BRET mist de technische problemen van bloeden door en hoge achtergrond fluorescentie maar mist de mogelijkheid om ruimtelijke informatie te verstrekken door het ontbreken van substraat lokalisatie van specifieke compartimenten 8. Over het geheel genomen BiFC is een uitstekende methode voor het visualiseren van subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen om inzicht te krijgen in gecompartimenteerde signalering.
Protocol
Discussion
BiFC is een uitstekende methode voor het visualiseren van eiwit: eiwit interacties in hele cellen en het bepalen van de subcellulaire lokalisatie van deze complexen. De voordelen van BiFC zijn dat alleen interagerende eiwitten fluorescent zijn, zijn van voorbijgaande aard interacties gestabiliseerd, en post-verwerking van de beeldgegevens is minimaal. Twee nadelen van deze methode zijn de rijping tijd voor de fluorofoor en de onomkeerbaarheid van fluorofoor complex. Onder sommige toepassingen is deze onomkeerbaarheid ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De ITSN, PI3K-C2β, en controle vectoren die in dit protocol zijn verkrijgbaar bij de auteurs op verzoek, voor niet-commerciële doeleinden. De auteurs willen dr. Chang-Deng Hu te erkennen voor het vriendelijk advies en de reagentia die worden gebruikt bij het vaststellen van de BiFC protocol in de O'Bryan laboratorium. KAW werd ondersteund door financiële steun van de Stichting Jerome Lejeune. Werk in het laboratorium O'Bryan wordt ondersteund door subsidies van de NIH (HL090651), DOD (PR080428), de St. Baldrick's Foundation, en de Stichting Jerome Lejeune.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-013 | ||
| Fetal bovine serum | Cellgro | 35-011-CV | ||
| Glass Bottom Microwell dishes | Matek | P35G-1.5-14C | ||
| 6-well dishes | Falcon | 35-3846 | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 18324020 | ||
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | ||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 META |
References
- Kerppola, T. K. Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40, 61-66 (2006).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies. Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).
- Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA). Methods. 40, 287-293 (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).
- Martin, N. P. Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling. Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).
- Das, M. Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3′-kinase C2beta-AKT pathway. Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).
- Mohney, R. P. Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving. JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).
- Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O’Bryan, J. P., McPherson, P. S. Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis. J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).
- Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O’Bryan, J. P. Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways. J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).
- O’Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. Mitogenesis and endocytosis: What’s at the INTERSECTIoN?. Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).
