Lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר Uncagable והעמסת dextran
Summary
פרוטוקול זה מתווה דרך התווית להתחקות אחר גורלו של קבוצות קטנות של דג הזברה עוברים התאים באמצעות UV-משחררות רפרוף של והעמסת בכלוב, ואחריו הר שלם immunolabeling כדי להגביר את האות והעמסת את שברחה מכלוב.
Abstract
הבעיה המרכזית בביולוגיה התפתחותית היא להסיק את מקורם של סוגי התאים הרבים המצויים חוליות כפי שהם נובעים מבשרי מובחן. חוקרים בשיטות שונות של תיוג השושלת, כגון תיוג DiI 1 ו הזרקה בלחץ של אנזימים למעקב 2 לגורל התא לברר בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות במערכות מודל. מפות גורל הראשון דג הזברה (Danio rerio) הורכבו על ידי הזרקת iontophoretic של צבעי ניאון, כגון rhodamine dextran, לתוך תאים בודדים באזורים נפרדים של העובר וכן מעקב גורל התא מסומן לאורך זמן 3-5. בעוד יעיל, שיטות אלו תובענית מבחינה טכנית דורשים ציוד מיוחד ולא נפוץ למצוא דג הזברה מעבדות. לאחרונה, חלבוני ניאון photoconvertable, כגון Eos ו קאךה, אשר באופן בלתי הפיך לעבור מירוק פלואורסצנטי אדום בעת חשיפה לאור אולטרה סגול, רואים שימוש מוגבר דג הזברה 6-8. בהירות אופטית של העובר דג הזברה ואת הקלות היחסית של transgenesis הפכו כלים אלה אטרקטיבי במיוחד עבור תיוג השושלת כדי לבחון את ההגירה של תאים in vivo 7. למרות השירות שלהם, חלבונים אלה יש כמה חסרונות לעומת לצבוע בתיווך שיטות תיוג השושלת. החשוב ביותר הוא הקושי שמצאנו בהשגת ברזולוציה גבוהה 3-D במהלך photoconversion של החלבונים האלה. לאור זאת, אולי את השילוב הטוב ביותר של ההחלטה וקלות השימוש עבור תיוג השושלת של דג הזברה עושה שימוש בכלוב והעמסת dextran, צבע פלואורסצנטי כי הוא מחויב לקבוצה מרווה כי מסכות 9 הקרינה שלה. לצבוע אז יכול להיות "שברחה מכלוב" (שוחרר מהקבוצה מרווה) בתוך תא ספציפי באמצעות אור UV ממנורת לייזר או כספית, המאפשר ויזואליזציה של הקרינה שלה או immunodetection. שלא כמו שיטות iontophoretic, והעמסת בכלוב ניתן להזריק עם מנגנוני זריקה סטנדרטיים שברחה מכלוב עם מיקרוסקופ epifluorescence מצויד חריר 10. בנוסף, נוגדנים נגד והעמסת לזהות רק את הטופס שברחה מכלוב, ו epitope שורד קיבעון גם 11. לבסוף, והעמסת בכלוב יכול להיות מופעל עם רזולוציה של 3-D גבוהות מאוד, במיוחד אם מיקרוסקופיה שני הפוטונים מועסק 12,13. פרוטוקול זה מתאר שיטת תיוג השושלת על ידי והעמסת בכלוב משחררות רפרוף לייזר. Subsequenctly, שברחה מכלוב והעמסת מזוהה בו זמנית על ידי סימון עם נוגדנים עם epitopes אחרים, כגון ה-GFP.
Protocol
Discussion
כפי שתואר, פרוטוקול זה מספק תיוג מהיר יחסית השושלת דג הזברה השיטה בנויה על טכניקות נפוץ של microinjection, מיקרוסקופיה, ו immunofluorescence. מצאנו כי הלייזר משחררות רפרוף להיות הדרך היעילה יעיל ביותר עלות uncage והעמסת באופן מקומי. שיטה זו יכולה לשמש תווית השושלת עם נקודות הקצה ניסיונ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות דן קרלין לעזרה בקבלת והעמסת בכלוב. בנוסף אנו רוצים להודות מקורות המימון הבאים: אוניברסיטת ונדרבילט תוכנית בית הספר לרפואה של גרנט לביולוגיה התפתחותית הכשרת הומ"ת, ו-NIH HD054534to JTG.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | ||
| Aminodextran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | ||
| Zeba desalt spin columns | Pierce | 89889 | ||
| goat anti-fluorescein antibody | Invitrogen | A11095 | ||
| Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody | Invitrogen | A21082 | ||
| 35mmx10mm petri dishes | Becton-Dickinson | 351008 | ||
| Upright compound microscope with 40x water immersion objective | Leica | DM6000B | ||
| MicroPoint Manual Laser Illumination System | Photonic Instruments | |||
| Phenylthiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | ||
| Tricaine | Sigma | E10521 | ||
| Proteinase K | Roche | 03115836991 | ||
| Plastic thread | Any sewing supply store | |||
| Agarose | Research Products International | A20090 | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD131DDA | ||
| Vortexing mixer | VWR | Vortex Genie 2 | ||
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
References
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. , 1-8 (1991).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
- Haugland, R. P. . Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. , 707-711 (2002).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).
