Lineage Маркировка данио рерио Клетки с лазерной Uncagable Fluorescein Декстран
Summary
Этот протокол описывает способ маркировать и отслеживать судьбу малых групп эмбрионов данио клетки с помощью УФ-uncaging в клетке флуоресцеина, после чего весь горе immunolabeling для усиления сигнала от Uncaged флуоресцеина.
Abstract
Центральной проблемой в биологии развития, является вывести происхождение множества типов клеток, присутствующих в позвоночных, как они возникают из недифференцированных предшественников. Исследователи использовали различные методы маркировки линии, такие как DII маркировки 1 и давление впрыска прослеживаемых ферменты 2 выяснить судьбу ячейки на более поздних стадиях развития в модельных системах. Первые карты судьбы в данио (Danio rerio) были собраны iontophoretic инъекции флуоресцентных красителей, таких, как родамин декстран, в одиночных камерах в дискретных регионов эмбриона и отслеживания судьбы помечены ячейки со временем 3-5. Хотя эффективные, эти методы технически сложные и требуют специализированного оборудования, не часто встречается в данио лабораториях. В последнее время photoconvertable флуоресцентные белки, такие как Eos и Kaede, который необратимо переключаться с зеленого на красный флуоресценции при воздействии ультрафиолетового света, видим широкое использование в данио 6-8. Оптическая ясность данио эмбриона и относительной легкостью трансгенеза сделали эти инструменты особенно привлекательными для линии маркировки и наблюдать миграцию клеток в естественных условиях 7. Несмотря на свою полезность, эти белки имеют некоторые недостатки по сравнению с красителем-опосредованных методов линии маркировки. Наиболее важным является трудность, мы нашли в получении высоких 3-D резолюции в ходе фотопреобразования этих белков. В свете этого, может быть, лучшее сочетание разрешение и простоту использования для маркировки линии в данио использует клетке флуоресцеина декстран, флуоресцентный краситель, который связан с тушением группа, которая маскирует его флуоресценции 9. Красителя может быть "Uncaged" (освобожден от закалки группы) в пределах определенной ячейке с помощью УФ света от лампы лазер или ртути, что позволяет визуализировать его флуоресценции или иммунодетекции. В отличие от iontophoretic методы, флуоресцеин клетке может быть введен со стандартными аппаратами впрыска и Uncaged с epifluorescence микроскопа, снабженного отверстием 10. Кроме того, антитела против флуоресцеина обнаружить только Uncaged форме, и эпитоп выживает фиксации и 11. Наконец, флуоресцеин клетке может быть активирована с очень высоким 3-D разрешение, особенно если двухфотонной микроскопии используется 12,13. Этот протокол описывает метод маркировки линии по клетке флуоресцеина и лазерной uncaging. Subsequenctly, Uncaged флуоресцеина обнаруживается одновременно с другими эпитопов, таких как GFP путем маркировки с антителами.
Protocol
Discussion
Как описано, этот протокол обеспечивает относительно быстрый метод линии маркировки в данио, которая построена на часто используемые методы микроинъекции, микроскопии и иммунофлюоресценции. Мы обнаружили, что лазерная uncaging быть наиболее эффективным и экономически эффективный спосо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Дэна Карлина за помощь в создании клетке флуоресцеина. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить следующих источников финансирования: Университет Вандербильта Медицинской школы Программа Развития Грант обучения биологии в ЕАК, и NIH HD054534to ОЦГ.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | ||
| Aminodextran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | ||
| Zeba desalt spin columns | Pierce | 89889 | ||
| goat anti-fluorescein antibody | Invitrogen | A11095 | ||
| Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody | Invitrogen | A21082 | ||
| 35mmx10mm petri dishes | Becton-Dickinson | 351008 | ||
| Upright compound microscope with 40x water immersion objective | Leica | DM6000B | ||
| MicroPoint Manual Laser Illumination System | Photonic Instruments | |||
| Phenylthiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | ||
| Tricaine | Sigma | E10521 | ||
| Proteinase K | Roche | 03115836991 | ||
| Plastic thread | Any sewing supply store | |||
| Agarose | Research Products International | A20090 | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD131DDA | ||
| Vortexing mixer | VWR | Vortex Genie 2 | ||
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
References
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. , 1-8 (1991).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
- Haugland, R. P. . Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. , 707-711 (2002).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).
