Lazer Uncagable Floresein Dextran'ın Zebra balığı Hücre Lineage Etiketleme
Summary
Bu protokol, Uncaged floresein gelen sinyali yükseltmek için immunolabeling tüm montaj takip kafesli flöresein UV uncaging kullanarak hücrelerin zebrafish embriyoların küçük gruplar kaderi etiket ve takip etmek için bir yol çizer.
Abstract
Gelişimsel biyoloji merkezi bir sorun farklılaşmamış öncüleri olarak ortaya çıkan omurgalıların bulunan sayısız hücre tiplerinin kökenini anlamak için. Araştırmacılar DII etiketleme 1 ve model sistemler geliştirme sonraki aşamalarında tespit hücre kaderinin izlenebilir enzimlerin basınçlı enjeksiyon 2 gibi soy etiketleme çeşitli yöntemleri, istihdam var. Zebra balığı (Danio rerio) ilk kaderi haritalar rodamin dekstran gibi floresan boyalar, iyontoforez enjeksiyon yoluyla embriyo ayrık bölgelerinde tek hücrelerin içine monte edilmiş ve üzerinden etiketli hücrenin kaderini izleme süresi 3-5. Etkili olsa da, bu yöntemlerin teknik olarak zor ve yaygın zebrafish laboratuarları bulunan olmayan özel ekipman gerektirmez. Son zamanlarda, ultraviyole ışığa maruz kaldığında yeşil kırmızı floresan geri dönüşümsüz geçiş Eos ve Kaede photoconvertable floresan proteinleri, zebrafish 6-8 artış görüyoruz. Zebrafish embriyo ve transgenesis göreli kolaylığı optik netlik soy etiketlenmesi için bu özellikle çekici araçlar yapmış ve in vivo 7 hücrelerin göç gözlemlemek için. Onların yardımcı programı olmasına rağmen, bu proteinlerin, boya-aracılı soy etiketleme yöntemleri, bazı dezavantajları karşılaştırıldığında var. En önemli zorluk biz Fotoçevrim sırasında bu proteinlerin 3 boyutlu yüksek çözünürlük elde bulduk. Bu ışık, belki de çözünürlüğü ve kullanım kolaylığı zebrafish soy etiketleme için en iyi kombinasyonu kafesli floresein dekstran kullanımı, su verme grubuna bağlı bir floresan boya yapar, maskeler, floresan 9 . Sonra boya, floresan veya İmmuno görselleştirme sağlayan bir lazer veya cıva lambası, UV ışık kullanarak belirli bir hücre içinde (su verme grubu serbest) "Uncaged" olabilir. Iyontoforez yöntemlerinin aksine, kafesli floresein standart enjeksiyon aparatları ile enjekte edilir ve bir iğne deliği 10 ile donatılmış bir Epifloresans mikroskop ile Uncaged. Buna ek olarak, floresein karşı antikor sadece Uncaged formu tespit ve epitop fiksasyonu iyi 11 hayatta. Son olarak, kafesli floresein iki foton mikroskopi 12,13 istihdam, özellikle çok yüksek 3-D çözünürlük ile aktive olabilir. Bu protokol, kafesli floresein ve lazer uncaging soy etiketleme bir yöntem açıklanır. Subsequenctly, Uncaged floresein antikorlar ile etiketleme gibi GFP gibi diğer epitopları ile eş zamanlı olarak algılanır.
Protocol
Discussion
Açıklandığı gibi, bu protokol, mikroenjeksiyon, mikroskopi ve immünofloresan sık kullanılan teknikler üzerine inşa edilmiştir zebrafish nispeten hızlı bir soy etiketleme yöntemi sağlar. Biz lazer yerelleştirilmiş bir moda flöresein uncage için en verimli ve maliyet etkin yolu olarak uncaging olduğunu bulduk. Bu yöntem 4 dpf'e gibi geç olarak deneysel uç noktaları ile soy etiket olabilir. Ancak, hücre bölünmeleri gibi, hücre başına kafesli-floresein toplama sonunda saptanabilir düzeyler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dan Carlin kafesli floresein yapımında yardım için teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak aşağıdaki finansman kaynakları teşekkür etmek istiyorum: JAC Gelişimsel Biyoloji Eğitimi Hibe Vanderbilt Üniversitesi Tıp Fakültesi Program ve NIH HD054534to JTG.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | ||
| Aminodextran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | ||
| Zeba desalt spin columns | Pierce | 89889 | ||
| goat anti-fluorescein antibody | Invitrogen | A11095 | ||
| Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody | Invitrogen | A21082 | ||
| 35mmx10mm petri dishes | Becton-Dickinson | 351008 | ||
| Upright compound microscope with 40x water immersion objective | Leica | DM6000B | ||
| MicroPoint Manual Laser Illumination System | Photonic Instruments | |||
| Phenylthiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | ||
| Tricaine | Sigma | E10521 | ||
| Proteinase K | Roche | 03115836991 | ||
| Plastic thread | Any sewing supply store | |||
| Agarose | Research Products International | A20090 | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD131DDA | ||
| Vortexing mixer | VWR | Vortex Genie 2 | ||
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
References
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. , 1-8 (1991).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
- Haugland, R. P. . Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. , 707-711 (2002).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).
