天堂斑马鱼的细胞标记与激光Uncagable荧光葡聚糖
Summary
该协议描绘的方式，标签和跟踪的小斑马鱼的胚胎细胞群体，使用紫外线uncaging笼荧光，整个装载免疫标记uncaged荧光信号放大的命运。
Abstract
发育生物学中的一个核心问题是演绎出无数的细胞类型，目前他们未分化的前体出现在脊椎动物的起源。研究人员所采用的谱系标签的各种方法，如DII 标签 1和压力注射溯源酶 2的模型系统开发的后期阶段，以确定细胞的命运。在斑马鱼（ 斑马鱼 ）的第一命运地图iontophoretic注射荧光染料如罗丹明右旋糖酐，组装，成单细胞在胚胎的离散地区和追踪标记细胞的命运，随着时间的推移3-5。这些方法虽然有效，技术要求高，需要专门的设备，不常用的斑马鱼实验室发现。最近，photoconvertable荧光蛋白，如EOS和枫，不可逆转的交换机从绿色变为红色荧光，当暴露在紫外线，增加使用在斑马鱼 6-8 。光学清晰度的转基因斑马鱼的胚胎和相对缓和这些谱系标签特别有吸引力的工具，并观察细胞的迁移，在体内7。尽管它们的效用，这些蛋白质有一些缺点相比，染料介导的宗族标记方法。最关键的是我们在发现这些蛋白质的光转化过程中获得3 – D分辨率高的困难。在这一点上，也许在斑马鱼的血统标签的决议和易用性的最佳结合 ，使得使用笼荧光葡聚糖，一种荧光染料，势必淬火组口罩荧光9。染料就可以“uncaged”（从淬火组发布）在一个特定的细胞使用激光或水银灯紫外线光，使荧光或免疫检测的可视化。笼荧光iontophoretic方法不同，可注射用标准的注射器具，并配备了一个针孔10 epifluorescence显微镜uncaged。此外，对荧光抗体检测只有uncaged形式，和抗原表位生存固定以及11。最后，笼中的荧光可以被激活，具有非常高的3 – D分辨率，特别是如果采用双光子显微镜12,13。这个协议描述笼荧光和激光uncaging宗族标签的方法。 Subsequenctly，uncaged荧光检测如GFP的其他抗原表位，同时通过与抗体标签。
Protocol
Discussion
如上所述，这个协议提供了相对快速的血统在斑马鱼标记法，显微注射法，显微镜，免疫后的常用技巧。我们发现，激光uncaging是最有效和最具成本效益的方式uncage在本地化时尚的荧光。这种方法可用于实验端点4 DPF后期谱系标签。然而，细胞分裂时，每个单元的笼荧光素浓度，最终跌幅超过检测水平。此外，已经出现了自发的，非特异性荧光uncaging的斑马鱼幼虫 11的报告。因此，uncag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们想感谢在笼中的荧光素丹卡林帮助。此外，我们想感谢以下资金来源：范德比尔特大学医学发育生物学培训资助计划学校，江淮，和美国国立卫生研究院HD054534to JTG。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | ||
| Aminodextran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | ||
| Zeba desalt spin columns | Pierce | 89889 | ||
| goat anti-fluorescein antibody | Invitrogen | A11095 | ||
| Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody | Invitrogen | A21082 | ||
| 35mmx10mm petri dishes | Becton-Dickinson | 351008 | ||
| Upright compound microscope with 40x water immersion objective | Leica | DM6000B | ||
| MicroPoint Manual Laser Illumination System | Photonic Instruments | |||
| Phenylthiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | ||
| Tricaine | Sigma | E10521 | ||
| Proteinase K | Roche | 03115836991 | ||
| Plastic thread | Any sewing supply store | |||
| Agarose | Research Products International | A20090 | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD131DDA | ||
| Vortexing mixer | VWR | Vortex Genie 2 | ||
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
References
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