共刺激シグナル遮断によるアロ抗原刺激によるヒト末梢血単核球のアロ抗原特異的アネルギーの誘導

Summary

本論文では、ヒト末梢血単核細胞にアロ抗原特異的アネルギーを誘発するための簡単​​なテクニックを説明します。技術は、非alloreactiveドナー細胞を生成するために臨床的に適用することができます。これらの細胞の注入は免疫再構築を改善し、同種造血幹細胞移植後の毒性を減らすことができる。

Abstract

同種造血幹細胞移植（AHSCT）は、先天性と後天血液疾患を持つ多くの患者の治療の最善の機会を提供しています。残念ながら、健康な患者の組織を認識し、損傷alloreactiveドナーT細胞の移植は、移植片対宿主病（GVHD）が¹になることがあります。成功AHSCTに1つの課題は、ドナーのT細胞、特に免疫再構築や再発の予防の有益な効果の関連を損なうことなく移植片対宿主病（GVHD）の予防です。 GVHDは、幹細胞の移植からまたは薬理学的免疫抑制の投与によるドナーT細胞の非特異的な枯渇することによって防ぐことができます。残念ながら、これらのアプローチは、感染や病気の再発^2-4増加させる。代替戦略は選択的に移植前にレシピエントの抗原提示細胞（APC）によってallostimulation後alloreactiveドナーT細胞を枯渇することです。これらallodepletion戦略の早期の臨床試験は、過剰な移植片対宿主病^{（GVHD）5、6}のないHLA不適合造血幹細胞移植後の免疫再構築を改善。ただし、一部のallodepletion技術は、特殊な受信者APCの生産^6、7を必要とし、いくつかのアプローチは、ドナー病原体特異的T細胞の枯渇⁸およびCD4を含むオフターゲット効果は⁹調節細胞をTをしている可能性があります。一つの代替的なアプローチがalloreactiveドナーT細胞の活性化です。アロ抗原特異的低応答性の誘導を介して。 CD28を介する共刺激シグナル¹⁰の封鎖を提供しながら、これは受信者APCとの刺激的なドナー細胞によって達成されます。試験管¹¹に病原体と腫瘍関連抗原のT細胞応答を維持しながら、この"alloanergization"アプローチは1-2ログで同種反応性を減少させる。戦略は、正常に完了したとalloanergizedドナーT細胞がHLA不適合急速な免疫再構築の結果として造血幹細胞移植、いくつかの感染症との歴史的な制御の受信者よりも重度の急性および慢性GVHDの間または後に注入された1進行中の臨床パイロット研究2で採用されているHLA不適合移植¹² unmanipulated。ここでは、HLA不適合無関係な刺激のPBMCにalloanergizedされた末梢血単核細胞（PBMC）の世代のための私達の現在のプロトコルを記述する。 AlloanergizationはCD28を介する共刺激をブロックするリガンドB7.1とB7.1に対するモノクローナル抗体の存在下でallostimulationによって実現されます。この技法は、特殊な刺激APCの生産を必要とし、唯一のシングルと、比較的簡単なex vivoでのインキュベーションのステップを必要とする、実行するのは簡単ですしていません。このように、アプローチは容易に低下同種反応性ドナーT細胞を生成するために臨床使用するための標準化が、過剰な移植片対宿主病（GVHD）なしで免疫再構築を改善するためにAHSCTの設定で養子移入するための病原体特異的免疫を保持することができます。

Protocol

<p class="jove_title"> 1。 PBMCの調製</p><ol><li良い無菌テクニックと普遍的予防策のための>手順については、このプロトコルの実施中に必ず守ってください。</li><li>フィコール – ハイパックを使用して密度勾配遠心分離によって健康なボランティアのドナーからのPBMC分離します。また凍結保存したPBMCを蘇生することができます。</li><li>血球計数器を用いてトリパンブルーで染色した後実行可能なPBMCを数えます。 15mlのファルコンチューブで100万生存細胞/ mLの濃度で完全培地に再懸濁しPBMC（CM）。</li></ol><p class="jove_title"> 2。バルクAlloanergizing共培養のセットアップ</p><ol><liつの異なるドナーから> PBMCをalloanergizationの文化を設定するために必要とされる。応答者と他のドナーからの細胞が刺激（ファーストパーティの刺激と呼ばれる）として機能するように1つのドナーからの細胞が配信されます。</li><li> 1 15 mLのファルコンチューブで100万/ mlで配置千万刺激PBMCと刺激をブロックする抗B7.2抗体の抗B7.1し、100mgの100mgのを追加します。静かにチューブを撹拌し、30分間インキュベートする。このとすべての後続のステップのためのインキュベーション条件は37℃/ 5％COです₂ /湿度80％</li><li>照射刺激PBMC（3.3 Gy）をし、T – 25 50センチメートルに追加<sup> 3</supガス透過性キャップ付き>細胞培養フラスコ。 "バルクalloanergizing共培養"フラスコにラベルを付けます。</li><li>フラスコにレスポンダーPBMC（CMで100万/ mlで）10mlのを追加。</li><li>抗B7.1、抗B7.2抗体の更なる100mgのそれぞれを追加し、72時間インキュベーター内で直立フラスコを置く前に静かに混和</li></ol><p class="jove_title"> 3。バルク、コントロール共培養のセットアップ</p><ol><li15mlのファルコンチューブに>配置千万刺激PBMC（100万/ mlで）。</li><li>照射千万刺激PBMC（3.3 Gy）を。と50センチメートルに追加³細胞培養フラスコ。ラベル"一括制御共培養"。</li><li>フラスコのCMで100万/ mlでレスポンダーPBMC 10mlのを追加し、72時間インキュベーター内で直立フラスコを置く前に穏やかに混合する。</li></ol><p class="jove_title"> 4。共刺激遮断の効果を測定する一次混合リンパ球反応（MLR）の設定</p><ol><li>共刺激遮断の有効性は、バルクalloanergizingと制御共培養由来のPBMCを用いて設定されている主なMLRで測定される</li><li>主要なMLRはバルクの文化が設定されていることを同じ日に設定されています</li><li測定される3つの時間ポイントの各々に対して>最初に名前が1 U底96ウェルプレート"プライマリMLR"（板の後4日目、5と6が設定されている）。</li><liバルク、コントロールの各から>デカント5mLのと15mlのファルコンチューブに共培養alloanergizing。</li><li各プレート上に3つのウェルにそれぞれファルコンチューブの細胞懸濁液>ピペット200mLの。ラベル共培養をalloanergizingバルクからのセルの一括制御共培養し、"CSB"からの細胞のためのこれらの井戸"無刺激の封鎖（CSB）"</li><li>ネガティブコントロールとして、各プレートに6ウェルにCMの200mLのを追加。 200mLのPBSは、蒸発を減らすために、すべての空のウェルに追加されます。インキュベーターでプレートを置きます。</li></ol><p class="jove_title"> 5。 Alloanergizationの効果を測定するセカンダリMLRの設定</p><ol><li> 72時間共培養バルクを設定した後、alloanergized PBMC中の残留alloresponsesは、二次MLRで測定されます。二次MLR、PBMCでバルクalloanergizing共培養し、バルク、コントロール共培養の両方から照射allostimulator PBMCで洗浄し、再刺激されています</li><li>二次MLRのラベルを設定するには一つのUは、（設定した後3日目、5と7）測定される3つの時間ポイントの各96ウェルプレート"セカンダリMLRを"底。</li><li>バルク、コントロールの各から5mLのを削除し、共培養をalloanergizing、15mlのファルコンチューブに移すと2000年で5〜10分間遠心し、注意深く上清をrpm.Aspirate、ペレットを混乱させる、CM 10mlのを追加し、再度細胞を遠心する。この洗浄工程を繰り返します。</li><li> CMの1mlの細胞を再懸濁します。トリパンブルー染色を用いて生細胞をカウント、および100万可能な応答細胞/ mLに細胞濃度を調整します。</li><li各プレートの3ウェルにそれぞれファルコンチューブの細胞懸濁液>ピペット100mLの。ラベルこれらの井戸"第一党（FP）allorestimulation"</li><li>ピペット各プレート上にさらに3ウェルにそれぞれファルコンチューブから細胞懸濁液の100mLをして、これらの井戸"CD3/28刺激"</li><li>二次MLRのために刺激細胞を準備するには、alloanergizingと対照培養の最初のパーティの刺激のPBMCを供給するために使用されるのと同じ健康なドナーから（または凍結保存PBMCを蘇生）新鮮な血液からPBMCを分離する。</li><li> 100万/ mL及び照射（3.3Gy）の濃度でFPのドナー由来のPBMCをサスペンド</li><li>"FP allorestimulation"というラベルのウェルに照射刺激細胞の100mLの追加</li><li>ポジティブコントロールについては、"CD3/28刺激"というラベルのウェルに1 mLのCD3のそれぞれとCD28モノクローナル抗体とCMの98mLを加える。空のウェルに陰性コントロールのPBS 200mLのように各プレートの6ウェルにCMの200mLを追加します。インキュベーターでプレートを置きます。</li></ol><p class="jove_title"> 6。 Alloanergizationの特異性を測定する</p><ol><li> alloanergizationの特異性は二次的に"第三者"健康なドナー（つまり、ファーストパーティの異なるドナー）から得られた照射PBMCによる刺激後に完了alloanergizingと制御共培養から採取した応答細胞の増殖を比較することによって決定されます。 MLR。</li><li>ラベルthree 96ウェルプレート"セカンダリMLRの特異性"3日目、5と7。</li><li>バルク、コントロールの各から5mLのを削除し、共培養を2000rpmで5〜10分間、15mlのファルコンチューブと遠心分離機への転送をalloanergizing。 、注意深く上清を吸引し、ペレットを混乱させる、CM 10mlのを追加し、再度細胞を遠心する。この洗浄工程を繰り返します。</li><li> CMの1mlの細胞を再懸濁します。トリパンブルー染色を用いてカウント、および100万可能な応答細胞/ mLに細胞濃度を調整します。</li><li>二次MLRのためにサードパーティの刺激細胞を準備するには、新しい健康なドナーから（または凍結保存PBMCを蘇生）新鮮な血液からPBMCを分離する。各プレートの3ウェルにそれぞれファルコンチューブの細胞懸濁液をピペットで100mLの。これらの井戸"TP allostimulationを"ラベルを付けます</li><li> 100万/ mL及び照射（3.3 Gy）をでTPのドナー由来のPBMCをサスペンド</li><li>"TP allostimulation"というラベルのウェルに照射TPの刺激細胞の200mLの追加</li><lialloanergizationの>特異性はまた、CMVなどの感染性病原体による刺激後に完了alloanergizingと制御共培養から採取した応答細胞の増殖を比較することによって決定することができる。このステップでは、それは以前に示した増殖反応とドナーからCMV溶解物にレスポンダーPBMCを使用することが不可欠です。</li><li>ラベルthree 96ウェルプレート"セカンダリMLR CMV"3日目、5と7。</li><li> CMVの応答を測定する二次MLRのための応答細胞を調製するために、バルク、コントロールのそれぞれから5 mlを転送し、15 mlチューブに共培養をalloanergizingと洗浄、前述のようにCMで100万細胞/ mlでカウントし、再懸濁各プレートの3ウェルにそれぞれファルコンチューブの細胞懸濁液。ピペット100mLを。</li><li>ウェルに100ul CMでCMV溶解液の0.1mLを追加</li><li>ネガティブコントロールとして、すべてのプレートの6ウェルにCMの200mLを加え、空のウェルにPBSの200mLのを追加します。インキュベーターでプレートを置きます。</li></ol><p class="jove_title"> 7。プライマリとセカンダリのMLRSの増殖を測定する</p><ol><li>レスポンダ細胞増殖は、プライマリとセカンダリのMLRSのチミジン取り込みアッセイによって測定されます。プライマリMLRプレートが設定されており、3日目、5と7で二次MLRプレートの後に設定された後に増殖は4日、5と6で測定されます。</li><liトリチウム化チミジンの> 1mCiは収穫前に井戸16時間に追加されます。</li><li>トリチウム化チミジンを添加後、プレートをTomtecハーベスターを（または類似）を使用してフィルターマット上に回収further16時間インキュベートする。空気乾燥してサンプルの袋の場所は、5mLのシンチレーション流体とシールを追加一時間filtermatを。ワラックマイクロベータシンチレーションカウンターまたは類似のプレートをお読みください。</li></ol><p class="jove_title"> 8。プライマリMLRに共刺激遮断の有効性を計算</p><ol><li>一次alloresponsesの阻害率（PI）を100として計算される[allostimulation井戸のCPM（バルクalloanergy共培養PBMC）を意味するX – } allostimulation井戸のCPM（バルク制御共培養PBMC）を意味する<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" /</li></ol><p class="jove_title"> 9。セカンダリMLRにAlloanergizationの有効性を計算</p><p class="jove_content">二次alloresponsesのPIは次のように計算されます<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" /</p><p class="jove_title"> 10。セカンダリMLRにおけるAlloanergizationの特異性を計算</p><ol><li> CD3とCD28、TPのallostimulatorsまたはCMVの抗原を持つ細胞の再刺激後に、これらの刺激に対する応答のPIは、この式を用いて計算することができます。これはalloanergizationプロセスの特異性の尺度を与える</li></ol><p class="jove_title"> 11。同種造血幹細胞移植（HSCT）後の臨床使用のためのAlloanergizedドナーのPBMCを生成</p><ol><li> AlloanergizedドナーPBMCは、上記で概説したプロトコルを使用して、HLA不適合同種HSCT後の臨床使用のために生成されることがあります</li><li>臨床使用のための細胞を生成する場合、レスポンダーPBMCを移植する前にHSCTレシピエントからHSCTのドナーと刺激PBMCから得られる。</li><li>臨床使用のためにPBMCを生成するとき、すべてのステップが認定幹細胞加工施設における適正製造プロセスの条件の下で実行されます。</li><li>その他の品質管理のアッセイは、臨床使用のための細胞のリリース前に安全基準を満たすためにエンドトキシンのアッセイおよびグラム染色および培養を含む実行されます</li></ol><p class="jove_title"> 12。代表的な結果</p><p class="jove_content"に見られるの>を使用してHLAを不一致刺激と応答者PBMC、主MLRにおける共刺激遮断の存在は、約30％（標準偏差 – – 10％、+ /を意味+ /）に5日目でレスポンダーPBMCの平均alloproliferationを削減共刺激遮断がない場合の制御の主MLR。 、D5で – これは、約70％（10％+ /）の一次alloproliferationの平均値抑制に相当します<strong>図1及びB</strong>。</p><p class="jove_content"> 5日目での二次MLRでは、alloanergized PBMCのFPのalloproliferationは、通常は10〜15％（+ / – 10％）である85から90パーセントの増殖の平均阻害（に制御PBMCと同等と見られるの+ / – 10 ％）、<strong>図2AおよびB</strong>。これはalloanergized PBMCは、FPのallostimulatorsにhyporesponsiveであることを示している。</p><p class="jove_content">これとは対照的にPBMCは、通常、マイトジェン（CD3/CD28抗体）、TPのallostimulatorsとCMV溶解液（CMV -反応性ドナーの）への増殖の70から100パーセントを保持alloanergized。これはalloanergized PBMCのその低応答性はFP同種抗原に特異的である示しています。</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong>図1。 A.</strong>増殖（チミジン取り込みによって決定される）が存在しないまたはヒト化モノクローナル抗B7.1とB7.2 -を使用して共刺激遮断の存在下でHLA -不一致刺激と応答者の末梢血単核細胞（PBMC）を使用してプライマリ混合リンパ球反応における抗体。結果は、ユニークな刺激 – 応答側のペアを使用して8代表的な実験の平均値（+ / – SD）として表示されます。<strong> B</strong>。ヒト化モノクローナル抗B7.1とB7.2 -抗体を用いた共刺激遮断の存在下で行う一次MLRSのalloproliferationの割合の抑制。結果を図1Aに示すように同じ8個の一意の刺激 – 応答側のペアの平均値（+ / – SD）として表示されます。</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong>図2。 A.</strongレスポンダーPBMCが不在（対照PBMC）または共刺激遮断（alloanergized PBMC）の存在下で行う主MLRSから照射ファーストパーティの刺激で再刺激された二次MLRSの>増殖（チミジン取り込みによって決定される）。結果を図1に示す8つのユニークな刺激 – 応答側のペアの平均値（+ / – SD）として表示されます。<strong> B</strong>。レスポンダーPBMCが不在（対照PBMC）または共刺激遮断（alloanergized PBMC）の存在下で行う主MLRSから照射ファーストパーティの刺激で再刺激されている二次MLRSのファーストパーティalloproliferationの割合の抑制。結果を図1及び図2Aに示す8つのユニークな刺激 – 応答側のペアのために（+ / – SD）平均として示されています。</p>

Discussion

<p class="jove_content">共刺激遮断の存在下でallostimulationを経由してドナーのPBMCにおけるアロ抗原特異的低応答性、またはアネルギーの誘導は、減少した同種反応性とドナーのPBMCを生成するための簡単​​なテクニックです。我々は実験室でのプロセスを開発し、現在はHLA不適合同種HSCT後の注入のための減少同種反応性とドナーのPBMCを生成するためにクリニックでの戦略を適用しています。このような治療を使用しての目的は、過剰な毒性なしで免疫再構築を改善することです。戦略の私達の現在の臨床応用は、同種HSCTの設定に制限されていますが、アプローチは、組織の損傷がそのような固形臓器移植や自己免疫疾患の拒絶反応などの不要なT細胞応答、によって引き起こされる他の設定に適用することができる。</p><p class="jove_content">いくつかの試薬はalloanergization共培養の過程でCD28を介する共刺激シグナルの遮断に使用することができます。ここでは、CD28のリガンド（B7.1およびB7.2）に対する臨床グレードのヒト化マウスモノクローナル抗体を使用して私たちの現在のプロトコルを記述する。非臨床グレードのマウス抗ヒトB7.1とB7.2抗体は、いくつかのメーカーから市販されている。あるいは、融合タンパク質細胞傷害性Tリンパ球抗原（CTLA）4免疫グロブリン（Ig）はalloanergizationプロセス中にCD28 -刺激をブロックするために使用することができます。 IgGのFcガンマ受容体にリンクされているCTLA4分子の細胞外部分で構成されてCTLA4 – Igは、、B7.1とB7.2に高い親和性で結合する。 CTLA4 – Igの使用は、ヒト末梢血のalloanergizationの同様の有効性と特異性をもたらす。</p><p class="jove_content"> alloanergizationの技法は、実行するのは簡単です。新鮮なまたは以前に凍結保存さ刺激のPBMCを、プロセスの結果に有意の変化で使用す​​ることができます。手順をソートせず、セルは1つだけの比較的簡単なex vivoでのインキュベーションのステップのための要件は、前臨床スケールで適用するための戦略が比較的単純になります注入に細胞死と細胞の細菌汚染の可能性最小限に抑えることができます。</p><p class="jove_content"我々が説明するアプローチ（および選択的にヒト細胞の同種反応性を減らすために他のアプローチ）の>制限の一つとして、残留同種反応性を決定するために、リアルタイムのアッセイの欠如です。増殖アッセイは、前に利用可能であるこれらのアッセイの結果に注入する必要があります同種反応性と臨床使用のために生成された細胞の減少を確認するために実行するために3-5日かかります。実行しやすいものの、さらに、チミジンの取り込みにより、末梢血単核球の増殖の測定は、T細胞の増殖に加えて、B細胞および他の細胞のサブセットの増殖を測定します。レスポンダーPBMCのCFSE色素の希釈は、代替のアッセイとして使用され、T細胞サブセット特異alloproliferationの決定を可能にすることができます。我々の戦略的アプローチの臨床応用を改善する方法の一つは、臨床使用のためのalloanergized細胞の放出前に実施することができます実行するためにわずか数時間を要する同種反応性のアッセイを開発し、検証することです。</p><p class="jove_content">特異性のalloanergizationのプロセスを確認することも重要である戦略のefficiacyを示すことに加えて。これは簡単にCMVの増殖反応の保全によって、サードパーティのallostimulatorsに固有alloresponsesの相対的な保全の決定とするときにCMV -反応性ドナー細胞がalloanergizedされていることによって行うことができます。</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Human AB serum (heat inactivated)	Gemini Bio-Products	100-512	Use validated batches
Complete Culture Media (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator	GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps	Corning, Inc.	3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies			See protocol text
U bottomed 96 well culture plates	BD Labware	353077
Monoclonal CD3 antibody	Beckman Coulter	IM0178	Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody	Beckman Coulter	IM1376	Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen	Microbix	EL-01-02
Tritiated Thymidine	NEN	NET027
Scintillation Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Printed Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filter Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter	Wallac