协同刺激信号封锁的同种抗原刺激诱导人外周血单个核细胞同种异体抗原特异性无能

Summary

本文介绍了一个简单的方法诱导人外周血单个核细胞同种异体抗原特异性无能。该技术可应用于临床，产生非同种异体的供体细胞。这些细胞输注可以提高免疫功能重建和减少异基因造血干细胞移植后的毒性。

Abstract

异基因造血干细胞移植（AHSCT）提供许多先天和后天的血液病病人治愈的最佳机会。不幸的是，承认并损害健康的病人组织的同种供体T细胞移植可以导致移植物抗宿主病^（GVHD）1 。成功AHSCT的挑战之一是预防GVHD没有相关的捐助者的T细胞，尤其是免疫重建和预防复发的有利影响的减值。 GVHD是可以预防的供者T细胞从干细胞移植或由行政药理免疫抑制非特异性枯竭。不幸的是，这些方法增加感染和^疾病的复发2-4。另一种策略是有选择性地消耗同种异体捐助者的T细胞后，由收件人抗原提呈细胞（APC）的移植前allostimulation。这些allodepletion战略的早期临床试验改进没有多余的^{GVHD 5，6} HLA不相合造血干细胞移植后免疫重建。然而，一些allodepletion技术要求专门收件人APC生产^6，7，脱靶效应，包括捐助病原体特异性T细胞和CD4枯竭调节性T细胞的一些方法可能有一个替代的方法是同种异体捐助者的T细胞的失活通过诱导对同种异体抗原特异性低反应。这是通过与受援国APC的刺激体细胞，同时提供CD28介导的共刺激^信号 10的封锁。这种“alloanergization”的做法降低了1-2日志alloreactivity，同时保留^在体外培养11的病原体和肿瘤相关抗原的T细胞反应。该战略已成功地采用了2完成和正在进行的临床试验alloanergized捐助者的T细胞被注入导致快速的免疫重建，感染少，比历史控制收件人的不太严重的急性和慢性GVHD的HLA不相合造血干细胞移植期间或之后的研究unmanipulated HLA不相合移植^12。在这里，我们描述当前的一代已alloanergized HLA不相合的无关刺激外周血单核细胞的外周血单个核细胞（PBMC）的协议。 Alloanergization是实现配体单克隆抗体的存在allostimulation B7.1和B7.1阻断CD28介导的共刺激。这种技术并不需要专门刺激APC的生产，是简单的执行，要求只有一个相对短暂的体外孵育阶段。因此，该方法可以很容易地供临床使用，捐助者的T细胞生成减少alloreactivity但保留病原体特异性免疫过继转移AHSCT改善没有过多的移植物抗宿主病的免疫重建的设置标准。

Protocol

<p class="jove_title"> 1。准备的PBMC</p><ol><li必须坚持良好的无菌技术和普及预防措施>的程序，在本议定书的行为。</li><li>隔离健康志愿者捐助者外周血单个核细胞，通过使用聚蔗糖离心Hypaque密度梯度。或者冷冻保存外周血单个核细胞可以复苏。</li><li>可行的外周血单个核细胞后，与台盼蓝染色使用血球计数。悬浮外周血单个核细胞完全培养基（CM）在1亿活菌/毫升15ML猎鹰管浓度。</li></ol><p class="jove_title"> 2。设置批量Alloanergizing共培养</p><ol><li>外周血单个核细胞，需要从两个不同的捐助者，成立alloanergization文化。细胞从一个捐助者将作为响应，并从另一位捐赠者的细胞，将作为刺激（被称为亲民党刺激）。</li><li>广场10万刺激外周血单核细胞在1万个/毫升在15毫升猎鹰管，并添加100毫克抗- B7.1和100毫克的抗B7.2抗体阻断共刺激。轻轻搅动管和孵育30分钟。和所有后续步骤的培养条件是37 ° C / 5％CO₂ / 80％湿度</li><li照射刺激外周血单个核细胞（3.3戈瑞），并添加了T – 2550厘米³细胞具有透气盖培养瓶。标签“散装alloanergizing合作文化”的烧瓶中。</li><li>应答者PBMC中添加10毫升（1万个/毫升在CM）的烧瓶。</li><li>再添加100毫克的抗B7.1和抗B7.2抗体，轻轻混匀直立放置在孵化器的烧瓶前72小时</li></ol><p class="jove_title"> 3。设置批量控制共培养</p><ol><li>放置10万（1万/ ml）刺激外周血单核细胞15ML猎鹰管。</li><li照射10万刺激外周血单个核细胞（3.3戈瑞），并添加到50厘米³细胞培养瓶。标签“批量控制共同的文化”。</li><li>新增1万个/毫升厘米的烧瓶应答者外周血单个核细胞10毫升，轻轻混匀烧瓶直立放置在一个孵化器，72小时前。</li></ol><p class="jove_title"> 4。设置小学混合淋巴细胞反应（MLR）来衡量的共同刺激封锁的功效</p><ol><li>共刺激封锁的疗效，是衡量这是使用散装alloanergizing和控制联合培养的PBMC中设立在基层国土资源部</li><li>小学国土资源部设立在同一天，散文化已成立</li><li>第一个标签一个U 96孔板来衡量（4日，5日和6板成立后）三个时间点“小国土资源部”触底反弹。</li><li>倒出5ML从每个批量控制和alloanergizing 15ML猎鹰管联合培养。</li><li>移液器200毫升的细胞悬浮液从每个猎鹰管到每盘一式三份井。标签这些井的“无共刺激封锁（CSB）”批量控制联合培养和“公务员事务局”从散装的细胞共培养的细胞alloanergizing</li><li>添加厘米至6井200毫升，每块板作为阴性对照。 200毫升PBS是添加到所有空井，以减少水分蒸发。在孵化器板。</li></ol><p class="jove_title"> 5。设置二次国土资源部来衡量Alloanergization疗效</p><ol><li设立散装联合培养72小时后，在alloanergized外周血单个核细胞的残余alloresponses在一，二级国土资源部测量。在二级国土资源部，PBMC的散装alloanergizing共同的文化和批量控制共培养照射allostimulator PBMC的清洗和restimulated</li><li>设置二级国土资源部标签一个U 96孔板来衡量（3，第5和第7日成立后）三个时间点的“二次国土资源部”触底反弹。</li><li>删除从批量控制每毫升和alloanergizing联合培养，转移到15ML猎鹰管，并在2000年5-10分钟离心rpm.Aspirate上清小心，扰乱沉淀，添加10毫升的CM，并再次离心细胞。重复此清洗步骤。</li><li>重悬细胞中的CM 1ML。采用台盼蓝染色计数活细胞，并调整细胞浓度至1万可行的响应者细胞/ mL。</li><li>移液器100毫升的细胞悬浮液从每个猎鹰管到每盘一式三份井。标签这些井“亲民党（FP）allorestimulation”</li><li>移液器100毫升细胞悬液从每个猎鹰管到每个板块和标签上进一步井这些井“CD3/28刺激”</li><li>要准备二次国土资源部刺激细胞，隔离外周血单个核细胞来自同一个健康的捐助，用于提供第一方刺激外周血alloanergizing和控制文化的新鲜血液（或复苏冻存的外周血单个核细胞）。</li><li暂停从FP的捐助1万/ ml和照射（3.3Gy）的浓度，外周血单个核细胞</li><li>添加100毫升的照射刺激细胞井标有“计划生育allorestimulation”</li><li>阳性对照，添加1毫升的CD3和CD28单克隆抗体和CM的98mL标有“CD3/28刺激”的水井。加入200毫升的PBS作为阴性对照和200ml到空井6口井每盘的CM。放置在孵化器的板块。</li></ol><p class="jove_title"> 6。测量Alloanergization特异性</p><ol><li> alloanergization特异性是由比较完成alloanergizing和控制联合培养后获得一个“第三者”健康捐赠者（即不同的捐助，以亲民党）在一，二级辐照外周血单个核细胞的刺激的应答者细胞的增殖国土资源部。</li><li>标签三个96孔板“中学国土资源部特殊性”的第3天，5和7。</li><li>删除从每个批量控制的5ML及alloanergizing 15ML猎鹰管转移到联合培养和5-10分钟2000转离心。小心吸出上清液，扰乱沉淀，添加10毫升的CM，并再次离心细胞。重复此清洗步骤。</li><li>重悬细胞中的CM 1ML。采用台盼蓝染色计数，调整细胞浓度至1万可行的响应者细胞/ mL。</li><li>要准备二次国土资源部第三方刺激细胞，从新鲜的血液，从一个新的健康捐赠者（或复苏冻存的外周血单核细胞）分离外周血单个核细胞。移液器100毫升细胞悬液从每个猎鹰管到每盘一式三份井。标签这些井的“TP allostimulation”</li><li暂停从一个TP捐助者外周血单个核细胞在1万/ ml和照射（3.3 GY）</li><li>添加辐照TP刺激细胞200ml到井标有“TP allostimulation”</li><li> alloanergization的特殊性，也可能是由比较完成alloanergizing和控制联合培养，如巨细胞病毒传染性病原体刺激后所采取的响应者细胞的增殖。对于这一步，它是必不可少的，使用应答者外周血单个核细胞与巨细胞裂解液，先前表现出增殖反应的捐助者。</li><li>标签3 96孔板“中学国土资源部巨细胞病毒”的第3天，5和7。</li><li要准备二次国土资源部响应细胞来衡量巨细胞病毒的反应，从每个批量控制转移5毫升和15毫升管alloanergizing共同的文化和洗涤，计数，重悬在CM在1万细胞/ ml如前所述。移液器从每个猎鹰管到每盘3口井100毫升细胞悬液。</li><li>在100ul厘米添加0.1毫升巨细胞裂解液井</li><li>添加200毫升的CM 6井在所有板块作为阴性对照，并添加200毫升的PBS空井。放置在孵化器的板块。</li></ol><p class="jove_title"> 7。在小学和中学的多管火箭炮系统的扩散测量</p><ol><li>响应细胞增殖是由胸腺嘧啶掺入法检测，在小学和中学MLRS测量。扩散测量后，基层国土资源部板成立后第3天，5和7中的国土资源部板设立的第4天，5日和6。</li><li>氚胸腺嘧啶1mCi收获之前添加到井16小时</li><li>后氚胸腺嘧啶此外，该板块孵育到过滤垫使用Tomtec收割机（或类似），然后收获了further16小时。风干一小时，然后放置在样品袋，加入5 mL闪烁液和密封的filtermat。阅读在Wallac微测试闪烁计数器或类似的板块。</li></ol><p class="jove_title"> 8。计算在小学国土资源部的联合刺激封锁的功效</p><ol><li>抑制初级alloresponses（PI）的百分比计算为100 × [allostimulation井平均CPM（散装alloanergy共培养外周血单核细胞） – 意味着在allostimulation井CPM（批量控制共同培养PBMC中）}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" /</li></ol><p class="jove_title"> 9。计算中国土资源部Alloanergization疗效</p><p class="jove_content">二次alloresponses的PI的计算公式为<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" /</p><p class="jove_title"> 10。计算中国土资源部Alloanergization特异性</p><ol><liTP allostimulators或巨细胞病毒抗原，有价证券的反应，这些刺激后CD3和CD28的细胞restimulation，也可能使用这个公式计算。这给出了一个衡量的alloanergization过程中的特殊性</li></ol><p class="jove_title"> 11。 Alloanergized捐助者外周血单个核细胞异体造血干细胞移植后的临床使用（HSCT）的生成</p><ol><li> Alloanergized捐助者外周血单个核细胞供临床使用后，可能会产生HLA不相合异基因造血干细胞移植使用上述协议</li><li当生成细胞供临床使用，响应者外周血单个核细胞的造血干细胞移植收件人事先移植的造血干细胞移植捐赠者和刺激外周血单核细胞获得。</li><li>当生成外周血单个核细胞供临床使用，所有步骤都认可的干细胞处理设施的良好生产工艺条件下进行。</li><li>附加质量控制检测，包括内毒素的检测和革兰氏染色和培养细胞释放之前，以满足临床使用的安全标准</li></ol><p class="jove_title"> 12。代表性的成果</p><p class="jove_content">使用HLA不相合的刺激和响应者外周血单个核细胞，在基层国土资源部共刺激封锁降低第5天的应答者外周血单个核细胞的平均alloproliferation，看到约30％（+ / – 标准差 – 10％，平均+ /）控制的主要国土资源部共刺激封锁的情况下。这相当于在D5的约70％（+ / – 10％）的主要alloproliferation的平均抑制，<strong图1 A和B</strong>。</p><p class="jove_content">在5天的第二国土资源部，FP alloproliferation alloanergized外周血单个核细胞通常是10-15％（+ / – 10％）与对照外周血单个核细胞，相当于平均85-90％的增殖抑制（，可见，+ / – 10 ％），<strong图2A和B</strong>。这表明，alloanergized PBMC的计划生育allostimulators低反应。</p><p class="jove_content"相比之下alloanergized PBMC的通常保持70-100％的增殖有丝分裂原（CD3/CD28抗体），TP allostimulators和巨细胞裂解液（CMV反应捐助者）。这表明，alloanergized外周血单个核细胞的低反应是具体的FP同种抗原。</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong>图1。 A。</strong>扩散（胸腺嘧啶掺入确定），在没有使用HLA不相合的刺激和急救员周边血液单核细胞（PBMC）的小学混合淋巴细胞反应或使用人性化的单克隆抗- B7.1和B7.2共刺激封锁存在抗体。结果显示平均为8代表的实验，使用独特的刺激反应对（+ / – SD）。<strong> B</strong>。在执行中存在共刺激封锁使用人性化的单克隆抗- B7.1和B7.2抗体的首要MLRS alloproliferation的抑制百分率。结果表明，意味着相同的8个不同的刺激应答描绘在图1A对（+ / – SD）。</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong>图2。 A。</strong>扩散（胸腺嘧啶掺入确定）应答者外周血单个核细胞在的情况下（对照PBMC）的共刺激封锁（alloanergized PBMC）的存在进行的主MLRS照射第一党刺激restimulated二次多管火箭炮。结果显示为（+ / – SD），平均为8图1中描绘的独特的刺激应答对。<strong> B</strong>。应答者外周血单个核细胞在的情况下（对照PBMC）的共刺激封锁（alloanergized PBMC）的存在进行的主MLRS照射第一党刺激restimulated二次MLRS亲民党alloproliferation抑制百分比。结果显示，平均为8个不同的刺激反应对描绘在图1和图2A（+ / – SD）。</p>

Discussion

<p class="jove_content">捐助者通过共刺激封锁的存在allostimulation外周血单核细胞诱导同种异体抗原特异性低反应，或无能，是一个简单的技术，为捐助者外周血单个核细胞生成减少alloreactivity。我们在实验室已经开发的过程，是目前应用在临床上的策略，生成与捐助者外周血单个核细胞HLA不相合的异基因造血干细胞移植后减少输液alloreactivity。使用这种疗法的目的是提高免疫功能重建，没有多余的毒性。虽然我国目前临床应用的策略是有限的异体造血干细胞移植的设置，这种方法可以适用于其他设置是不必要的T细胞反应，如实体器官移植排斥反应或自身免疫性疾病，引起组织损伤。</p><p class="jove_content">若干试剂可用于阻断CD28介导的共刺激信号在alloanergization合作文化的过程中。在这里，我们描述了我们目前的协议，使用临床级人性化的小鼠单克隆抗体，针对CD28的配体（B7.1和B7.2）。非临床级小鼠抗人B7.1和B7.2抗体均为市售从几个厂家。另外，融合蛋白的细胞毒性T淋巴细胞抗原（CTLA）4免疫球蛋白（IG），可用于阻止在alloanergization过程中CD28的共刺激。 CTLA4 – Ig融合，其中的CTLA4分子的IgG的Fc伽玛受体的胞外部分组成，具有高亲和力结合B7.1和B7.2。使用CTLA4 – Ig融合结果类似的疗效和alloanergization人类外周血单核细胞特异性。</p><p class="jove_content"> alloanergization技术是简单的执行。新鲜或以前冻存的刺激外周血单个核细胞，可用于没有显着变化，在这一进程的结果。只有一个相对短暂的体外细胞没有排序程序孵育阶段的要求，最大限度地减少细胞死亡和细胞细菌污染输液的策略相对简单，适用于规模的临床前的潜力。</p><p class="jove_content">描述的方法，我们（和其他方法，有选择地降低人体细胞的alloreactivity）的限制之一是缺乏实时检测，以确定剩余alloreactivity。增殖实验需要3-5天的时间来执行确认的减少alloreactivity和细胞供临床使用，必须注入之前，这些可用的检测结果。此外，测量TdR掺入外周血单个核细胞的增殖，虽然易于操作，除了T细胞增殖的措施，B细胞及其他细胞亚群的增殖。 CFSE染料稀释应答者外周血，可以用来作为备用的检测和许可证测定T细胞亚群的具体alloproliferation。将开发和验证alloreactivity检测，只需要几个小时来执行，可以执行alloanergized细胞供临床使用之前释放的一种方式，以改善我们的战略方法的临床应用。</p><p class="jove_content">除了展示战略同样重要的是确认的特殊性alloanergization过程efficiacy。这可以很容易地做到的决心alloresponses特定第三方allostimulators相对保存时，巨细胞病毒反应的供体细胞正在alloanergized，保存，以巨细胞病毒的增殖反应</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Human AB serum (heat inactivated)	Gemini Bio-Products	100-512	Use validated batches
Complete Culture Media (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator	GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps	Corning, Inc.	3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies			See protocol text
U bottomed 96 well culture plates	BD Labware	353077
Monoclonal CD3 antibody	Beckman Coulter	IM0178	Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody	Beckman Coulter	IM1376	Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen	Microbix	EL-01-02
Tritiated Thymidine	NEN	NET027
Scintillation Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Printed Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filter Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter	Wallac