Induktion von Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen durch Alloantigen Stimulation mit Co-stimulatorische Signal Blockade

Summary

Dieses Papier beschreibt eine einfache Technik, um Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen zu induzieren. Die Technik kann klinisch angewendet werden, um nicht alloreaktive Spenderzellen zu generieren. Infusion dieser Zellen verbessern könnte Immunrekonstitution und reduzieren Toxizität nach allogener Stammzelltransplantation.

Abstract

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (AHSCT) bietet die beste Chance auf Heilung für viele Patienten mit angeborenen und erworbenen hämatologischen Erkrankungen. Leider kann die Transplantation von alloreaktive Spender T-Zellen, die erkennen und Schäden gesunden Patienten Gewebe in Graft-versus-Host Disease (GvHD) ¹ führen. Eine Herausforderung für eine erfolgreiche AHSCT ist die Vermeidung von GvHD ohne zugehörige Beeinträchtigung der vorteilhaften Wirkungen von Spender-T-Zellen, insbesondere Immunrekonstitution und Rezidivprophylaxe. GvHD kann durch nicht-spezifische Depletion von Spender-T-Zellen aus Stammzellen Transplantate oder durch die Verabreichung von pharmakologischen Immunsuppression verhindert werden. Leider sind diese Ansätze erhöhen Infektion und Erkrankung Rückfall ^2-4. Eine alternative Strategie besteht darin, selektiv führen alloreaktive Spender-T-Zellen nach allostimulation durch den Empfänger Antigen-präsentierende Zellen (APC) vor der Transplantation. Frühe klinische Studien mit diesen allodepletion Strategien verbessert Immunrekonstitution nach HLA-übereinstimmenden HSCT ohne Selbstbeteiligung GvHD ^{5, 6.} Allerdings verlangen einige allodepletion Techniken spezialisiert Empfänger APC Produktion ^{6, 7} und einige Ansätze können off-target-Effekte, einschließlich Abbau von Spender-Erreger-spezifische T-Zellen ⁸ und CD4 T regulatorischen Zellen ^9. Ein alternativer Ansatz ist die Inaktivierung von alloreaktive Spender T-Zellen über die Induktion von Alloantigen-spezifische Immunantwort. Dies ist durch die Stimulierung Spenderzellen mit Empfänger APC erreicht und gleichzeitig Blockade des CD28-vermittelten Ko-Stimulation Signale ^10. Diese "alloanergization"-Ansatz reduziert Alloreaktivität um 1-2 logs unter Beibehaltung pathogen-und Tumor-assoziiertes Antigen T-Zell-Antworten in vitro ¹¹ . Die Strategie ist erfolgreich in 2 abgeschlossen und 1 laufenden klinischen Pilotstudien, in denen alloanergized Spender T-Zellen während oder nach der HLA-übereinstimmenden HSCT was zu einer schnellen Wiederherstellung des Immunsystems, Infektionen wenige und weniger schwere akute und chronische GvHD als historische Kontrolle Empfänger infundiert wurden eingesetzt unmanipulierten HLA-übereinstimmenden Transplantation ^12. Hier beschreiben wir unsere aktuelle Protokoll für die Erzeugung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC), die HLA-übereinstimmenden unabhängig Stimulator PBMC wurden alloanergized. Alloanergization wird durch allostimulation in Gegenwart von monoklonalen Antikörpern gegen die Liganden erreicht B7.1 und B7.1 nach CD28-vermittelten Kostimulation zu blockieren. Diese Technik erfordert nicht die Herstellung von spezialisierten Stimulator APC und ist einfach durchzuführen und erfordert nur einen einzigen und relativ kurze ex vivo Inkubationsschritt. Als solcher kann der Ansatz leicht standardisiert für den klinischen Einsatz zur Spender-T-Zellen mit reduzierter Alloreaktivität, jedoch unter Beibehaltung pathogen-spezifische Immunität für adoptiven Transfer in der Einstellung der AHSCT zu Immunrekonstitution ohne übermäßige GvHD zu verbessern generieren.

Protocol

<p class="jove_title"> 1 ist. Vorbereitung der PBMC</p><ol><li> Verfahren für eine gute aseptische Technik und universellen Vorsichtsmaßnahmen müssen während der Durchführung dieses Protokolls eingehalten werden.</li><li> Isolate von gesunden freiwilligen Spendern PBMC durch Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Hypaque. Alternativ kryokonservierten PBMC können wiederbelebt werden.</li><li> Graf lebensfähig PBMC nach Färbung mit Trypanblau mit einer Zählkammer. Resuspendieren PBMC in völliger Kulturmedien (CM) in einer Konzentration von 1 Mio. lebensfähige Zellen / ml in einem 15 ml Falcon-Röhrchen.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Einrichten der Bulk Alloanergizing Co-Kultur</p><ol><li> PBMCs von zwei verschiedenen Spendern sind nötig, um die alloanergization Kulturen. Zellen von einem Spender dienen als Responder und Zellen von einem anderen Spender als Stimulator (der so genannten First Party Stimulator) dienen soll.</li><li> Platz 10 Mio. Stimulator PBMC bei 1 Mio / ml in einem 15 mL Falcon-Röhrchen und fügen 100mg Anti-B7.1 und 100mg Anti B7.2 Antikörper gegen Kostimulation zu blockieren. Vorsichtig geschwenkt, das Rohr und Inkubation für 30 Minuten. Inkubationsbedingungen für diese und alle weiteren Schritte sind 37 ° C / 5% CO₂ / 80% Luftfeuchtigkeit</li><li> Bestrahlen Stimulator PBMC (3,3 Gy) und fügen Sie einen T-25 50cm³ Zellkulturflasche mit einer gasdurchlässigen Kappe. Beschriften Sie die Flasche "Bulk alloanergizing Co-Kultur".</li><li> Add 10mL der Responder PBMC (bei 1 Mio / ml in CM) in den Kolben.</li><li> Fügen Sie eine weitere 100mg jeder anti-B7.1 und B7.2 anti-Antikörper und vorsichtig mischen vor dem Platzieren der Kolben aufrecht in einem Inkubator für 72 Stunden</li></ol><p class="jove_title"> 3. Einrichten des Bulk-Control-Co-Kultur</p><ol><li> Platz 10 Mio. Stimulator PBMC (bei 1 Mio / ml) in einem 15 ml Falcon-Röhrchen.</li><li> Bestrahlen 10 Millionen Stimulator PBMC (3,3 Gy). Und fügen eine 50cm³ Zellkulturflasche. Label "Bulk-Steuerung Co-Kultur".</li><li> Add 10mL der Responder PBMC bei 1 Mio / ml in CM in den Kolben und vorsichtig mischen vor dem Platzieren der Kolben aufrecht in einem Inkubator für 72 Stunden.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Einrichten des primären gemischten Lymphozyten-Reaktion (MLR), um die Wirksamkeit von Co-stimulatorische Blockade Measure</p><ol><li> Die Wirksamkeit von kostimulatorischen Blockade ist in eine primäre MLR, die bis über PBMC von der Masse alloanergizing und Kontrolle Co-Kulturen eingestellt ist gemessen</li><li> Der primäre MLR wird am selben Tag, dass der Großteil Kulturen eingerichtet wurden eingestellt</li><li> First-Label ein U Talsohle 96 Well-Platte "Primary MLR" für jeden der drei Zeitpunkten gemessen werden soll (Tag 4, 5 und 6 nach der Platten eingerichtet sind) werden.</li><li> Dekantieren 5 ml von jeder der Bulk-Steuerung und alloanergizing Co-Kulturen in 15 mL Falcon-Röhrchen.</li><li> Pipette 200 ml Zellsuspension aus jedes Falcon-Röhrchen in dreifacher Ausfertigung Brunnen auf jeder Platte. Label diese Brunnen "keine kostimulatorischen Blockade (CSB)" für die Zellen aus dem Bulk-Steuerung Co-Kulturen und "CSB" für die Zellen von der Masse alloanergizing Co-Kulturen</li><li> Add 200 ml CM bis 6 Bohrungen auf jeder Platte als negative Kontrollen. 200 ml PBS ist es, alle leeren Vertiefungen gegeben, um Verdunstung zu reduzieren. Legen Platten in den Inkubator.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Einrichten des sekundären MLR, die Wirksamkeit von Alloanergization Measure</p><ol><li> 72 Stunden nach dem Einrichten des Bulk-Co-Kulturen sind Rest-alloresponses in alloanergized PBMCs in eine sekundäre MLR gemessen. In der sekundären MLR, PBMC von beiden den Großteil alloanergizing Co-Kultur und der Großteil Kontrolle Co-Kultur werden gewaschen und mit bestrahlten allostimulator PBMC restimuliert</li><li> So richten Sie die sekundäre MLR-Label ein U Talsohle 96 Well-Platte "Secondary MLR" für jeden der drei Zeitpunkten gemessen werden soll (Tag 3, 5 und 7 nach Einrichtung) werden.</li><li> Entfernen 5mL aus jedem der Bulk-Steuerung und alloanergizing Co-Kulturen, Transfer zum 15mL Falcon-und Zentrifugenröhrchen für 5-10 Minuten bei 2000 rpm.Aspirate den Überstand vorsichtig, stören das Pellet, fügen Sie 10 mL der CM und Zentrifuge die Zellen wieder. Wiederholen Sie diesen Waschschritt.</li><li> Resuspendieren der Zellen in 1ml von CM. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypan-Blau-Färbung, und passen Sie die Zellkonzentration auf 1 Mio. lebensfähige Responder-Zellen / ml.</li><li> Pipette 100 ml Zellsuspension aus jedes Falcon-Röhrchen in dreifacher Ausfertigung Vertiefungen jeder Platte. Label diese Brunnen "First Party (FP) allorestimulation"</li><li> Pipette 100 ml Zellsuspension aus jedes Falcon-Röhrchen in eine weitere 3 Brunnen auf jeder Platte und Label diese Brunnen "CD3/28 Stimulation"</li><li> Um Stimulatorzellen für die sekundäre MLR vorzubereiten, zu isolieren PBMC aus frischem Blut (oder wieder zu beleben kryokonservierten PBMC) aus dem gleichen gesunden Spenders verwendet werden, um erste Partei Stimulator PBMCs in der alloanergizing und Kontrolle Kulturen zu versorgen.</li><li> Suspend PBMC aus dem FP-Donor in einer Konzentration von 1 Mio / ml und bestrahlen (3.3Gy)</li><li> Add 100 ml von bestrahlten Stimulator-Zellen in die Vertiefungen der Aufschrift "FP allorestimulation"</li><li> Für positive Steuerelemente, Add je 1 mL der CD3-und CD28 monoklonalen Antikörpern und 98mL des CM in die Vertiefungen der Aufschrift "CD3/28 Stimulation". Add 200 ml CM bis 6 Bohrungen auf jeder Platte als negative Kontrolle und 200ml PBS zu leeren Brunnen. Legen Sie die Platten in den Inkubator.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Die Messung der Spezifität der Alloanergization</p><ol><li> Die Spezifität der alloanergization wird durch den Vergleich Proliferation von Responder-Zellen aus dem abgeschlossenen alloanergizing und Kontrolle Co-Kulturen nach Stimulation mit bestrahlten PBMC von einer "dritten Partei" gesunden Spenders (dh eine andere Geber für die First Party) in eine sekundäre eingenommen bestimmt MLR.</li><li> Label drei 96-Well-Platten "Secondary MLR Spezifität" Day 3, 5 und 7.</li><li> Entfernen 5mL aus jedem der Bulk-Steuerung und alloanergizing Co-Kulturen Transfer zum 15mL Falcon-und Zentrifugenröhrchen für 5-10 Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute. Saugen Sie den Überstand vorsichtig, stören das Pellet, fügen Sie 10 mL der CM und Zentrifuge die Zellen wieder. Wiederholen Sie diesen Waschschritt.</li><li> Resuspendieren der Zellen in 1ml von CM. Zählung mit Trypanblau-Färbung, und passen Sie die Zellkonzentration auf 1 Mio. lebensfähige Responder-Zellen / ml.</li><li> Zum Dritten Stimulatorzellen für die sekundäre MLR vorzubereiten, zu isolieren PBMC aus frischem Blut (oder wieder zu beleben kryokonservierten PBMC) aus einer neuen gesunden Spenders. Pipette 100 ml Zellsuspension aus jedes Falcon-Röhrchen in dreifacher Ausfertigung Vertiefungen jeder Platte. Label diese Brunnen "TP allostimulation"</li><li> Suspend PBMC von einem TP Spender auf 1 Million / ml und bestrahlen (3,3 Gy)</li><li> Add 200 ml bestrahlter TP Stimulatorzellen in die Vertiefungen der Aufschrift "TP allostimulation"</li><li> Die Spezifität der alloanergization kann auch durch einen Vergleich Proliferation von Responder-Zellen aus dem abgeschlossenen alloanergizing und Kontrolle Co-Kulturen nach Stimulation mit einer ansteckenden Erreger wie CMV festgestellt werden. Für diesen Schritt ist es wichtig, Responder PBMC von Spendern mit zuvor gezeigt, proliferative Reaktionen auf CMV-Lysat verwenden.</li><li> Label drei 96-Well-Platten "Secondary MLR CMV" Day 3, 5 und 7.</li><li> Zur Vorbereitung der Responder-Zellen für die sekundäre MLR zu CMV Reaktionen zu messen, Transfer 5 ml von jeder der Bulk-Steuerung und alloanergizing Co-Kulturen bis 15 ml-Tuben und waschen, zu zählen und bei 1 Mio. Zellen / ml resuspendieren in CM, wie zuvor beschrieben . Pipette 100 ml Zellsuspension aus jedes Falcon-Röhrchen in ein 3 Bohrungen auf jeder Platte.</li><li> Add 0,1 ml CMV-Lysat in 100 ul CM in die Vertiefungen</li><li> Add 200 ml CM bis 6 Bohrungen auf allen Platten als negative Kontrolle und fügen 200ml PBS zu leeren Brunnen. Legen Sie die Platten in den Inkubator.</li></ol><p class="jove_title"> 7. Mess-Proliferation in der primären und sekundären MLR</p><ol><li> Responder Zellproliferation wird durch Thymidin-Assay in der primären und sekundären MLR gemessen. Proliferation ist an Tag 4, 5 und 6 gemessen, nachdem die primäre MLR Platten aufgebaut und sind an Tag 3, 5 und 7 nach der Secondary MLR Platten sind eingerichtet.</li><li> 1mCi von Tritium-Thymidin wird in die Vertiefungen 16 Stunden vor der Ernte aufgenommen</li><li> Nach der Zugabe von Tritium-Thymidin wird die Platte für eine further16 Stunden, dann auf eine Filtermatte mit einer Tomtec Mähdrescher (oder ähnlich) geerntet inkubiert. Der Luft trocknen die Filtermatte für eine Stunde dann in einen Beutel, 5 ml Szintillationsflüssigkeit und Dichtung. Lesen Sie die Platte in einem Wallac Micro beta Szintillationszähler oder ähnliches.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Die Berechnung der Wirksamkeit von Co-stimulatorische Blockade in der primären MLR</p><ol><li> Die prozentuale Hemmung (PI) der primären alloresponses als 100 berechnet x [Mittelwert cpm in allostimulation Brunnen (bulk alloanergy Co-Kultur PBMC) – Mittelwert cpm in allostimulation Brunnen (bulk Kontrolle Co-Kultur PBMC)}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" /</li></ol><p class="jove_title"> 9. Die Berechnung der Wirksamkeit von Alloanergization in den sekundären MLR</p><p class="jove_content"> Die PI von sekundären alloresponses wird wie folgt berechnet<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" /</p><p class="jove_title"> 10. Die Berechnung der Spezifität der Alloanergization in den sekundären MLR</p><ol><li> Nach Restimulation der Zellen mit CD3-und CD28, kann TP allostimulators oder CMV-Antigen, das PI der Reaktionen auf diese Reize auch mit Hilfe dieser Formel werden. Das gibt ein Maß für die Spezifität der alloanergization Prozess</li></ol><p class="jove_title"> 11. Generieren Alloanergized Donor PBMC für den klinischen Einsatz nach einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT)</p><ol><li> Alloanergized Spender PBMC kann für den klinischen Gebrauch nach HLA-übereinstimmenden allogene Stammzelltransplantation unter Verwendung des Protokolls oben skizzierten erzeugt werden</li><li> Bei der Generierung von Zellen für die klinische Anwendung, Responder PBMC aus der HSCT Spender und Stimulator PBMC aus der HSCT Empfänger vor der Transplantation erhalten.</li><li> Bei der Generierung von PBMC für den klinischen Einsatz, alle Schritte werden unter Good Manufacturing Prozessbedingungen in akkreditierten Stammzell-Verarbeitungsanlagen durchgeführt.</li><li> Zusätzliche Qualitätskontrolle Assays sind auch Endotoxin-Assays und Gramfärbung und Kultur Sicherheitskriterien vor der Veröffentlichung von Zellen zu treffen für den klinischen Einsatz durchgeführt</li></ol><p class="jove_title"> 12. Repräsentative Ergebnisse</p><p class="jove_content"> Mit HLA-übereinstimmenden Stimulator und Responder PBMC, die Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade in der primären MLR reduziert bedeuten alloproliferation der Responder PBMC an Tag 5 bis ca. 30% (+ / – 10%, Mittelwert + / – Standardabweichung), die gesehen in Kontrolle primäre MLR in Abwesenheit des kostimulatorischen Blockade. Dies entspricht einer mittleren Hemmung der primären alloproliferation von rund 70% (+ / – 10%) bei D5,<strong> Abbildung 1 A und B</strong>.</p><p class="jove_content"> In der sekundären MLR an Tag 5, FP alloproliferation von alloanergized PBMC in der Regel 10-15% (+ / – 10%), die mit Kontroll-PBMC entspricht einer mittleren Hemmung der Proliferation von 85-90% (sehen + / – 10 %),<strong> Abbildung 2A und B</strong>. Dies zeigt, dass alloanergized PBMC hyporesponsive zu FP allostimulators sind.</p><p class="jove_content"> Im Gegensatz alloanergized PBMC behalten typischerweise 70-100% ihrer Verbreitung auf Mitogene (CD3/CD28 Antikörper), TP allostimulators und CMV-Lysat (in CMV-reaktive Geber). Dies zeigt, dass hyporesponsive von alloanergized PBMC ist spezifisch für FP Alloantigene.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong> Abbildung 1. A.</strong> Proliferation (bestimmt durch Thymidin) in einer primären gemischten Lymphozyten-Reaktion mit HLA-übereinstimmenden Stimulator und Responder peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) in Abwesenheit oder Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade mit humanisierten monoklonalen anti-B7.1 und B7.2- Antikörper. Die Ergebnisse werden als Mittelwert (+ /-SD) für 8 repräsentativen Experimenten unter Verwendung der einzigartigen Stimulator-Responder-Paare dargestellt.<strong> B</strong>. Prozentuale Hemmung der alloproliferation in primäre MLR in Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade mit humanisierten monoklonalen anti-B7.1 und B7.2-Antikörper durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert (+ /-SD) für den gleichen 8 einzigartige Stimulator-Responder-Paare in Abbildung 1A dargestellt gezeigt.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong> Abbildung 2. A.</strong> Proliferation (bestimmt durch Thymidin) in sekundäre MLR, wo Responder PBMC aus primären MLR in Abwesenheit (Kontrolle PBMC) oder die Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade (alloanergized PBMC) durchgeführt mit bestrahlten erste Partei Stimulatoren restimuliert sind. Die Ergebnisse werden als Mittelwert (+ /-SD) für die 8 einzigartige Stimulator-Responder-Paare in Abbildung 1 dargestellt angezeigt.<strong> B</strong>. Prozentuale Hemmung der First Party alloproliferation in sekundäre MLR, wo Responder PBMC aus primären MLR in Abwesenheit (Kontrolle PBMC) oder die Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade (alloanergized PBMC) durchgeführt mit bestrahlten erste Partei Stimulatoren restimuliert sind. Die Ergebnisse werden als Mittelwert (+ /-SD) für die 8 einzigartige Stimulator-Responder-Paare in Abbildung 1 und Abbildung 2A dargestellt gezeigt.</p>

Discussion

<p class="jove_content"> Die Induktion von Alloantigen-spezifische Immunantwort, oder Anergie, in Spender PBMC über allostimulation in Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade ist eine einfache Technik für die Erzeugung von Spender PBMC mit reduzierter Alloreaktivität. Wir haben den Prozess im Labor entwickelt und werden derzeit die Anwendung der Strategie in die Klinik, um Spender PBMC mit reduzierter Alloreaktivität für Infusion nach HLA-übereinstimmenden allogene Stammzelltransplantation zu generieren. Das Ziel des Einsatzes dieser Therapie ist es, Immunrekonstitution ohne übermäßige Toxizität zu verbessern. Obwohl unsere aktuellen klinischen Anwendung der Strategie, um die Einstellung der allogenen HSCT begrenzt ist, könnte der Ansatz auch auf andere Situationen, in denen Gewebeschäden durch unerwünschte T-Zell-Antworten, wie die Ablehnung einer soliden Organtransplantation oder Autoimmunerkrankungen verursacht wird, angewendet werden.</p><p class="jove_content"> Mehrere Reagenzien für Blockade des CD28-vermittelten kostimulatorische Signale während der alloanergization Co-Kultur eingesetzt werden. Hier beschreiben wir unsere aktuellen Protokoll mit klinisch-grade humanisierte monoklonale Antikörper gegen den Liganden von CD28 (B7.1 und B7.2) gerichtet. Nicht-klinische grade murine anti-human B7.1 und B7.2 Antikörper sind im Handel von verschiedenen Herstellern erhältlich. Alternativ kann das Fusionsprotein zytotoxische T-Lymphozyten Antigen (CTLA) 4-Immunglobulin (Ig) verwendet werden, um CD28-Kostimulation während der alloanergization Prozess blockieren. CTLA4-Ig, der aus den extrazellulären Teil des CTLA4 Molekül im Zusammenhang mit dem IgG Fc-gamma Rezeptor besteht, bindet mit hoher Affinität an B7.1 und B7.2. Die Verwendung von CTLA4-Ig Ergebnisse in eine ähnliche Wirksamkeit und Spezifität der alloanergization von humanen PBMCs.</p><p class="jove_content"> Die Technik der alloanergization ist einfach durchzuführen. Frische oder zuvor kryokonservierten Stimulator PBMCs mit keine signifikanten Unterschiede in den Ergebnissen des Prozesses verwendet werden. Die Forderung nach nur einem relativ kurzen ex vivo Inkubationsschritt ohne cell sorting Verfahren minimiert Potenzial für Zelltod und Bakterienbefall der Zellen vor der Infusion, die die Strategie relativ einfach zu einem klinischen Maßstab gelten lässt.</p><p class="jove_content"> Eine Einschränkung der Ansatz, den wir beschreiben (und andere Ansätze zur selektiven Reduktion Alloreaktivität von menschlichen Zellen) ist das Fehlen einer Echtzeit-Test, um restliches Alloreaktivität bestimmen. Proliferationstests nehmen 3-5 Tage durchführen, um die Reduktion von Alloreaktivität und Zellen für die klinische Anwendung generiert bestätigen müssen, bevor die Ergebnisse dieser Tests zur Verfügung stehen infundiert werden. Darüber hinaus Messung der Proliferation von PBMCs von Thymidin, obwohl leicht durchzuführen, Maßnahmen Proliferation von B-Zellen und anderen Zellen-Untergruppen zusätzlich zu T-Zell-Proliferation. CFSE Farbstoffverdünnungskurve der Responder PBMCs kann als eine alternative Assay verwendet werden und ermöglicht die Bestimmung von T-Zell-Untergruppe-spezifische alloproliferation. Eine Möglichkeit, die klinische Anwendung unserer Strategie-Ansatz zu verbessern wäre, die Entwicklung und Validierung eines Assays von Alloreaktivität, dass nur wenige Stunden in Anspruch, die vor durchgeführt werden könnten, um von alloanergized Zellen für die klinische Anwendung Release dauert.</p><p class="jove_content"> Neben dem Nachweis der efficiacy der Strategie ist es auch wichtig, um die Spezifität alloanergization zu bestätigen. Dies kann leicht durch Bestimmung der relativen Erhaltung der alloresponses spezifischen Dritter allostimulators und wenn CMV-reaktive Spenderzellen werden alloanergized getan werden, um den Erhalt der proliferativen Reaktionen auf CMV</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Human AB serum (heat inactivated)	Gemini Bio-Products	100-512	Use validated batches
Complete Culture Media (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator	GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps	Corning, Inc.	3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies			See protocol text
U bottomed 96 well culture plates	BD Labware	353077
Monoclonal CD3 antibody	Beckman Coulter	IM0178	Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody	Beckman Coulter	IM1376	Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen	Microbix	EL-01-02
Tritiated Thymidine	NEN	NET027
Scintillation Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Printed Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filter Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter	Wallac