אינדוקציה של Anergy Alloantigen ספציפיים בתוך האדם תאים דם היקפיים mononuclear על ידי גירוי Alloantigen עם המצור Co-גירוי אותות

Summary

מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לגרום alloantigen ספציפי anergy בבני אדם בתאי הדם ההיקפיים mononuclear. הטכניקה ניתן ליישם קלינית כדי ליצור אי – alloreactive תאים התורם. עירוי של תאים אלה יכול לשפר את הכינון מחדש החיסון ולהפחית רעילות לאחר השתלה אלוגנאית גזע hematopoietic התא.

Abstract

Allogeneic hematopoietic בתאי גזע להשתלה (AHSCT) מציע את הסיכוי הטוב ביותר של תרופה עבור חולים רבים עם מחלות המטולוגיות מולד ונרכש. למרבה הצער, השתלת alloreactive T תאים התורם אשר לזהות נזק לרקמות החולה בריא יכול לגרום למחלת השתל נגד מארח (GVHD) ^1. אתגר אחד כדי AHSCT מוצלח הוא מניעת GVHD ללא פגיעה הקשורים של ההשפעות המיטיבות של T לתאי התורם, הכינון מחדש החיסונית במיוחד ומניעת הישנות. GVHD ניתן למנוע על ידי צמצום הלא ספציפית של תאים התורם T מ שתלי בתאי גזע או על ידי מתן החיסון תרופתי. למרבה הצער גישות אלו להגדיל את זיהום ומחלות הישנות ^2-4. אסטרטגיה חלופית היא סלקטיבית לרוקן alloreactive T תאים התורם לאחר allostimulation ידי אנטיגן תאים הנמען להציג (APC) לפני ההשתלה. בניסויים קליניים מוקדמים אלה אסטרטגיות allodepletion משופרת הכינון מחדש החיסונית לאחר HSCT HLA-GVHD תואמים ללא עודף ^{5, 6.} עם זאת, כמה טכניקות allodepletion דורשים המתמחה בייצור הנמען APC ^{6, 7} וגישות מסוימים עשויים להיות מחוץ היעד תופעות כולל דלדול של פתוגן ספציפי בתאי התורם T מסוג CD4 ו – ⁸ תאים T רגולטוריים ^9. אחת גישה חלופית היא איון של תאים T alloreactive התורם באמצעות אינדוקציה של hyporesponsiveness alloantigen ספציפיים. זו מושגת על ידי תאים התורם מגרה עם הנמען APC תוך מתן המצור של CD28 בתיווך שיתוף גירוי אותות ^10. גישה זו "alloanergization" מפחית alloreactivity על ידי 1-2 יומני תוך שמירה על הפתוגן ו גידולים הקשורים T אנטיגן התגובות תא במבחנה ¹¹ . האסטרטגיה הועסק בהצלחה 2 הושלם 1 מחקרים מתמשכים פיילוט קליני אשר alloanergized T לתאי התורם היו חדורים במהלך או לאחר HSCT HLA-תואמים והתוצאה היא מהירה ושיחזור החיסונית, זיהומים כמה GVHD אקוטי וכרוני פחות חמור מקבלי השליטה ההיסטורית של unmanipulated HLA-תואמים השתלה ^12. כאן אנו מתארים את פרוטוקול הנוכחי שלנו עבור הדור של כדוריות דם היקפיים mononuclear (PBMC) אשר היו alloanergized כדי PBMC HLA-תואמים ממריץ קשור. Alloanergization מושגת על ידי allostimulation בנוכחות נוגדנים חד שבטיים על ligands B7.1 ו B7.1 לחסום CD28 בתיווך costimulation. טכניקה זו אינה דורשת את ייצור המתמחה ממריץ APC והוא פשוט לביצוע, הדורש רק vivo יחיד קצרה יחסית לשעבר שלב הדגירה. ככזה, הגישה יכולה להיות סטנדרטית בקלות לשימוש קליני לייצר T התורם תאים עם alloreactivity מופחת אך שמירה על הפתוגן הספציפי חסינות להעברת המאמצת בסביבה של AHSCT הכינון מחדש כדי לשפר את החיסון ללא GVHD מוגזמת.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. הכנת PBMC</p><ol><li> נוהלי aseptic טכניקה טובה אמצעי זהירות אוניברסליים חייב להיות דבק במהלך התנהלותו של פרוטוקול זה.</li><li> בודד PBMC מתורמים מתנדבים בריאים על ידי צנטריפוגה צפיפות שיפוע באמצעות Ficoll-Hypaque. לחילופין PBMC cryopreserved ניתן החייאה.</li><li> ספירת PBMC קיימא לאחר מכתים עם Trypan כחול באמצעות hemocytometer. Resuspend PBMC בתקשורת תרבות שלמה (CM) בריכוז של 1 מיליון תאים קיימא / mL בצינור פלקון 15 מ"ל.</li></ol><p class="jove_title"> 2. הקמת Alloanergizing גורפת שיתוף תרבות</p><ol><li> PBMCs משני תורמים שונים יש צורך להגדיר את התרבויות alloanergization. תאים מתורם אחד ישמש המגיב ותאים מתורם אחר ישמש ממריץ (שמכונה ממריץ מפלגת הראשון).</li><li> מקום 10,000,000 ממריץ PBMC ב 1 מיליון / מ"ל ​​צינור פלקון 15 מ"ל ולהוסיף 100 מ"ג של אנטי B7.1 ו 100 מ"ג של B7.2 נוגדנים אנטי לחסום costimulation. בעדינות להתסיס את הצינור דגירה במשך 30 דקות. תנאי דגירה עבור זה את כל הצעדים הבאים הם CO 37 ° C / 5%₂ / 80% לחות</li><li> מקרינים ממריץ PBMC (3.3 Gy) ולהוסיף T-25 50 ס"מ³ תרבית תאים בקבוק עם כובע גז חדיר. תווית הבקבוק "גורפת alloanergizing שיתוף תרבות".</li><li> הוסף 10 מ"ל של המגיב PBMC (ב 1 מיליון / מ"ל ​​ב CM) אל הבקבוק.</li><li> הוספת 100 מ"ג עוד אחד B7.2 נוגדנים נגד B7.1 ואנטי ומערבבים בעדינות לפני הצבת את הבקבוק זקוף באינקובטור למשך 72 שעות</li></ol><p class="jove_title"> 3. הגדרת הבקרה גורפת שיתוף תרבות</p><ol><li> מקום 10,000,000 ממריץ PBMC (ב 1 מיליון / מ"ל) בצינור פלקון 15 מ"ל.</li><li> 10000000 מקרינים ממריץ PBMC (3.3 Gy). ומוסיפים 50 ס"מ³ תרבות בקבוק התא. לייבל ". גורפת לשלוט שיתוף תרבות"</li><li> הוסף 10 מ"ל של המגיב PBMC בבית מ"ל 1 / מיליון CM אל הבקבוק ומערבבים בעדינות לפני הצבת את הבקבוק זקוף באינקובטור למשך 72 שעות.</li></ol><p class="jove_title"> 4. הגדרת את התגובה ראשי הלימפוציטים מעורבים (הקה"ע) כדי למדוד את היעילות של המצור Co-גירוי</p><ol><li> היעילות של המצור costimulatory נמדדת הקה"ע ראשוני אשר מוגדר באמצעות PBMC מ alloanergizing רוב ושליטה משותפת תרבויות</li><li> הקה"ע העיקרית היא להקים באותו יום כי תרבויות בתפזורת הוקמו</li><li> תווית קודם באחד U תחתית 96 גם צלחת "הקה"ע ראשי" עבור כל אחת משלוש נקודות זמן ניתן למדוד (יום 4, 5 ו -6 לאחר הצלחות מוגדרים).</li><li> 5 מ"ל למזוג מכל אחד לשלוט בכמויות alloanergizing שיתוף תרבויות לתוך צינורות פלקון 15 מ"ל.</li><li> 200 מ"ל פיפטה של ​​השעיה תא מהצינור כל פלקון לתוך בארות בשלושה עותקים על כל צלחת. תוויות אלה בארות "לא למצור costimulatory (CSB)" עבור התאים משליטת בתפזורת שיתוף תרבויות "CSB" עבור תאים בתפזורת alloanergizing שיתוף תרבויות</li><li> הוסף 200 מ"ל של ס"מ עד 6 בארות על כל צלחת כפקדי שלילית. 200 מ"ל PBS מתווסף כל בארות ריק כדי להפחית את אידוי. המקום צלחות בחממה.</li></ol><p class="jove_title"> 5. הגדרת הקה"ע משני למדוד את היעילות של Alloanergization</p><ol><li> 72 שעות לאחר הגדרת את עיקר שיתוף תרבויות, alloresponses שיורית PBMCs alloanergized נמדדים הקה"ע משנית. ב המשני הקה"ע, PBMC משני תרבות שיתוף בתפזורת alloanergizing והשליטה בתפזורת שיתוף תרבות נשטפים ו restimulated עם מוקרן allostimulator PBMC</li><li> כדי להגדיר את התווית משני הקה"ע one U תחתית 96 גם צלחת "הקה"ע משני" עבור כל אחת משלוש נקודות זמן ניתן למדוד (יום 3, 5 ו – 7 לאחר הקימה).</li><li> הסרת 5 מ"ל מכל אחד לשלוט בכמויות alloanergizing שיתוף תרבויות, להעביר צינורות פלקון 15 מ"ל ו צנטריפוגות למשך 5-10 דקות ב 2000 rpm.Aspirate supernatant בקפידה, לשבש את גלולה, להוסיף 10 מ"ל של סי צנטריפוגות התאים שוב. חזור על שלב זה כביסה.</li><li> Resuspend התאים 1mL של CM. ספירת התאים קיימא באמצעות מכתים Trypan כחול, ולהתאים את ריכוז התאים עד 1 מיליון תאים קיימא המגיב / mL.</li><li> 100 מ"ל פיפטה של ​​השעיה תא מהצינור כל פלקון לתוך בארות בשלושה עותקים של כל צלחת. תוויות אלה בארות "ראשית המפלגה (FP) allorestimulation"</li><li> 100 מ"ל פיפטה של ​​השעיה תא מהצינור כל פלקון לתוך 3 בארות נוספות על כל צלחת ואת התווית אלה בארות "CD3/28 גירוי"</li><li> כדי להכין תאים ממריץ את הקה"ע משנית, לבודד PBMC של דם טרי (או להחיות PBMC cryopreserved) מתורם בריא המשמשים לאספקת first ממריץ PBMCs המפלגה alloanergizing ותרבויות שליטה.</li><li> להשעות PBMC מתורם FP בריכוז של 1 מ"ל / מיליון מקרינים (3.3Gy)</li><li> הוסף 100 מ"ל של תאים ממריץ מוקרן לבארות שכותרתו "FP allorestimulation"</li><li> עבור פקדים חיובית, להוסיף 1 מ"ל כל אחד CD3 ו נוגדנים חד שבטיים CD28 ו 98mL של CM לבארות שכותרתו "גירוי CD3/28". מוסיפים 200 מ"ל של ס"מ עד 6 בארות על כל צלחת כביקורת שלילית של 200 מ"ל PBS לבארות ריק. מקמי את הצלחות בחממה.</li></ol><p class="jove_title"> 6. מדידת הספציפיות של Alloanergization</p><ol><li> הספציפיות של alloanergization נקבע על ידי השוואת התרבות התאים שנלקחו המגיב alloanergizing השלימה ושליטה משותפת בתרבויות לאחר גירוי עם PBMC מוקרן המתקבל "צד שלישי" תורם בריא (כלומר תורם שונים המפלגה ראשון) ב משנית הקה"ע.</li><li> לייבל three 96 צלחות טוב "משני הקה"ע ספציפיות" יום 3, 5 ו -7.</li><li> הסרת 5 מ"ל מכל אחד לשלוט בכמויות alloanergizing שיתוף תרבויות להעביר מבחנות פלקון 15 מ"ל ו צנטריפוגות למשך 5-10 דקות ב 2000 סל"ד. לשאוב supernatant בקפידה, לשבש את גלולה, להוסיף 10 מ"ל של סי צנטריפוגות התאים שוב. חזור על שלב זה כביסה.</li><li> Resuspend התאים 1mL של CM. לספור באמצעות מכתים Trypan כחול, ולהתאים את ריכוז התאים עד 1 מיליון תאים קיימא המגיב / mL.</li><li> כדי להכין third ממריץ תאים מסיבה הקה"ע משנית, לבודד PBMC של דם טרי (או להחיות PBMC cryopreserved) מתורם בריא חדש. פיפטה 100 מ"ל של השעיה תא מהצינור כל פלקון לתוך בארות בשלושה עותקים של כל צלחת. תוויות אלה בארות "TP allostimulation"</li><li> להשעות PBMC מתורם TP ב מ"ל 1 / מיליון מקרינים (3.3 Gy)</li><li> הוסף 200 מ"ל של תאים מוקרן TP ממריץ כדי "allostimulation TP" בארות שכותרתו</li><li> הספציפיות של alloanergization יכול להיות גם נקבע על ידי השוואת התרבות התאים שנלקחו המגיב alloanergizing השלימה ושליטה משותפת בתרבויות לאחר גירוי עם הפתוגן זיהומיות כגון CMV. במשך שלב זה הכרחי להשתמש המגיב PBMC מתורמים עם תגובות שגשוג הפגינו בעבר ל-CMV lysate.</li><li> לייבל three 96 צלחות טוב "משני הקה"ע CMV" יום 3, 5 ו -7.</li><li> כדי להכין את התאים המגיב עבור הקה"ע משני למדוד את התגובות CMV, העברת 5 מ"ל מכל אחד לשלוט בכמויות alloanergizing שיתוף תרבויות עד 15 צינורות מ"ל ולשטוף, לספור resuspend ב 1 מיליון תאים / מ"ל ​​ב CM כפי שתואר לעיל . פיפטה 100 מ"ל של השעיה תא מהצינור כל פלקון לתוך 3 בארות על כל צלחת.</li><li> הוסף 0.1 מ"ל של CMV lysate ב 100ul CM לבארות</li><li> הוסף 200 מ"ל של ס"מ עד 6 בארות בצלחת כל כביקורת שלילית להוסיף 200 מ"ל של PBS לבארות ריק. מקמי את הצלחות בחממה.</li></ol><p class="jove_title"> 7. מדידת תפוצה ב MLRs יסודי ותיכון</p><ol><li> הפצת Responder תא נמדדת assay thymidine ההתאגדות של MLRs יסודי ותיכון. הפצה נמדדת ב 4 הימים, 5 ו -6 לאחר הצלחות ראשי הקה"ע מוגדרים ועל יום 3, 5 ו – 7 אחרי הצלחות משני הקה"ע מוגדרים.</li><li> 1mCi של thymidine tritiated מתווסף בארות 16 שעות לפני קציר</li><li> לאחר תוספת של thymidine tritiated, צלחת הוא מודגרות במשך שעות further16 שנקטפו אז על מחצלת מסנן באמצעות מקצרה Tomtec (או דומה). אוויר יבש filtermat במשך שעה אחת לאחר מכן מקום בתיק המדגם, להוסיף 5 מ"ל נוזל הנצנץ ואת החותם. קרא את הצלחת נצנוץ מיקרו בטא Wallac דלפק או דומה.</li></ol><p class="jove_title"> 8. חישוב יעילות של המצור Co-גירוי של הקה"ע ראשי</p><ol><li> עיכוב אחוז (PI) של alloresponses העיקרי מחושב 100 x [מתכוון לאלף הופעות allostimulation בארות (בתפזורת שיתוף תרבות alloanergy PBMC) – ממוצע לדקה ב allostimulation בארות (בתפזורת שיתוף תרבות לשלוט PBMC)}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" /</li></ol><p class="jove_title"> 9. חישוב יעילות של Alloanergization ב הקה"ע משני</p><p class="jove_content"> PI של alloresponses משני מחושב<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" /</p><p class="jove_title"> 10. חישוב הספציפיות של Alloanergization ב הקה"ע משני</p><ol><li> לאחר restimulation של תאים עם CD3 ו CD28, allostimulators TP או אנטיגן CMV, לצרכן של התגובות לגירויים אלו עשויים גם להיות מחושב באמצעות נוסחה זו. זה נותן מידה של סגוליות של תהליך alloanergization</li></ol><p class="jove_title"> 11. יצירת PBMC התורם Alloanergized לשימוש קליני לאחר השתלה אלוגנאית גזע hematopoietic תא (HSCT)</p><ol><li> PBMC התורם Alloanergized עלול להיווצר לשימוש קליני לאחר HSCT HLA-תואמים אלוגנאית באמצעות פרוטוקול שתוארו לעיל</li><li> בעת יצירת תאים לשימוש קליני, המגיב PBMC מתקבלים התורם HSCT ו ממריץ PBMC מן הנמען HSCT לפני ההשתלה.</li><li> בעת יצירת PBMC לשימוש קליני, כל הצעדים מבוצעים תחת תנאים טובים תהליך ייצור של מתקני מוכר תא גזע עיבוד.</li><li> נוסף מבחני בקרת איכות מבוצעים כולל מבחני רעלן פנימי ואת כתם גרם ותרבות לעמוד בקריטריונים בטיחות לפני שחרורו של התאים לשימוש קליני</li></ol><p class="jove_title"> 12. נציג תוצאות</p><p class="jove_content"> שימוש HLA-תואמים ממריץ ואת המגיב PBMC, הנוכחות של המצור costimulatory ב הקה"ע ראשונית מפחית alloproliferation ממוצע של המגיב PBMC בכל יום 5 עד% סביב 30 (+ / – 10%, כלומר + / – סטיית התקן) של זה לראות השליטה העיקרי הקה"ע בהעדר המצור costimulatory. זה שווה עיכוב ממוצע של alloproliferation העיקרי של סביב 70% (+ / – 10%) ב D5,<strong> איור 1 A ו-B</strong>.</p><p class="jove_content"> ב הקה"ע משני יום ב 5, alloproliferation FP של PBMC alloanergized הוא בדרך כלל 10-15% (+ / – 10%) זה נראה עם שווה PBMC שליטה עיכוב ממוצע של הפצת 85-90% (+ / – 10 %),<strong> איור 2A ו-B</strong>. זה מוכיח כי PBMC alloanergized הם hyporesponsive כדי allostimulators FP.</p><p class="jove_content"> ב PBMC בניגוד alloanergized בדרך כלל לשמור על 7-10% של התפשטות שלהם mitogens (CD3/CD28 נוגדנים), allostimulators TP ו CMV lysate (ב CMV-reactive תורמים). זה מוכיח כי hyporesponsiveness של PBMC alloanergized ספציפי FP alloantigens.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" /<br /><strong> באיור 1. א</strong> הפצת נשק גרעיני (נקבע על ידי שילוב thymidine) בתגובה ראשונית הלימפוציטים מעורבים באמצעות HLA-תואמים ממריץ תאים המגיב דם היקפיים mononuclear (PBMC) בהעדר או נוכחות של המצור costimulatory באמצעות אנושי חד שבטיים אנטי B7.1 ו-B7.2 נוגדנים. התוצאות מוצגות כממוצע (+ /-SD) עבור 8 ניסויים נציג משתמש ייחודי ממריץ-המגיב בזוגות.<strong> B</strong>. אחוז עיכוב alloproliferation ב MLRs ראשונית שבוצעה בנוכחות המצור costimulatory באמצעות אנושי חד שבטיים אנטי B7.1 ו-B7.2 נוגדנים. התוצאות מוצגות כממוצע (+ /-SD) עבור אותו ממריץ 8-המגיב זוגות ייחודי מתואר באיור 1 א.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" /<br /><strong> באיור 2. א</strong> הפצת נשק גרעיני (נקבע על ידי שילוב thymidine) ב MLRs משני שם המגיב PBMC מ MLRs ראשונית שבוצעה בהעדר (שליטה PBMC) או נוכחות של המצור costimulatory (PBMC alloanergized) הם restimulated עם מוקרן לגירוי המסיבה הראשונה. התוצאות מוצגות כממוצע (+ /-SD) עבור 8 ממריץ-המגיב זוגות ייחודי מתואר באיור 1.<strong> B</strong>. אחוז עיכוב alloproliferation המפלגה הראשונה MLRs משני שם המגיב PBMC מ MLRs ראשונית שבוצעה בהעדר (שליטה PBMC) או נוכחות של המצור costimulatory (PBMC alloanergized) הם restimulated עם מוקרן לגירוי המסיבה הראשונה. התוצאות מוצגות כממוצע (+ /-SD) עבור 8 ממריץ-המגיב זוגות ייחודי מתואר באיור איור 1 ו 2A.</p>

Discussion

<p class="jove_content"> אינדוקציה של hyporesponsiveness alloantigen ספציפי, או anergy, ב PBMC התורם באמצעות allostimulation בנוכחות המצור שיתוף גירוי היא טכניקה פשוטה עבור הדור של PBMC התורם עם alloreactivity מופחת. פיתחנו את התהליך במעבדה כרגע מיישמים את האסטרטגיה במרפאה ליצור PBMC התורם עם alloreactivity מופחת עבור עירוי לאחר HSCT HLA-תואמים allogeneic. מטרת באמצעות טיפול כזה היא לשפר את הכינון מחדש החיסון ללא רעילות עודף. למרות היישום הקליני הנוכחי של האסטרטגיה היא מוגבלת להגדרה של allogeneic HSCT, הגישה יכול להיות מיושם על הגדרות אחרות בהן נזק לרקמות נגרמת על ידי תא T תגובות לא רצויות, כגון דחיית השתלת איברים מוצקים או מחלות אוטואימוניות.</p><p class="jove_content"> מספר ריאגנטים יכול לשמש המצור של CD28 בתיווך שיתוף גירוי אותות בתהליך alloanergization שיתוף תרבות. כאן אנו מתארים את פרוטוקול הנוכחי שלנו באמצעות קליני כיתה נוגדנים חד שבטיים אנושי Murine מכוונת נגד ligands של CD28 (B7.1 ו B7.2). Non-קליני כיתה Murine אנטי אנושי B7.1 ו B7.2 נוגדנים זמינים מסחרית של יצרנים שונים. לחלופין, החלבון היתוך ציטוטוקסיות לימפוציטים T Antigen (CTLA) 4 אימונוגלובולין (איג) ניתן להשתמש כדי לחסום CD28-costimulation בתהליך alloanergization. CTLA4-איג, אשר מורכב של החלק תאיים של המולקולה CTLA4 קשורה לקולטן הגמא IgG FC, נקשר בזיקה גבוהה B7.1 ו B7.2. השימוש CTLA4-איג תוצאות יעילות וספציפיות דומים של alloanergization PBMCs של האדם.</p><p class="jove_content"> הטכניקה של alloanergization היא פשוטה לביצוע. טריים או cryopreserved בעבר PBMCs ממריץ ניתן להשתמש עם וריאציה לא משמעותי התוצאה של התהליך. הדרישה רק צעד אחד קצר יחסית vivo הדגירה לשעבר עם תא ללא הליכי מיון ממזער פוטנציאל למוות התא זיהום חיידקי של תאים לפני עירוי מה שהופך את האסטרטגיה פשוטה יחסית ליישם בקנה מידה קליניות.</p><p class="jove_content"> מגבלה אחת של הגישה שאנו מתארים (גישות אחרות כדי להפחית alloreactivity סלקטיבי של תאים אנושיים) הוא היעדר assay בזמן אמת כדי לקבוע alloreactivity שיורית. מבחני הפצת לקחת 3-5 ימים לבצע כדי לאשר את הפחתת alloreactivity ותאי שנוצר לשימוש קליני חייב להיות חדורים לפני התוצאות של מבחני אלה להיות זמינים. יתר על כן, מדידת תפוצת PBMCs ידי שילוב thymidine, אם כי קל לבצע, אמצעי התרבות התאים B ו תת תאים אחרים בנוסף התפשטות תאים טי. לצבוע CFSE דילול של המגיב PBMCs יכול לשמש assay חלופי היתרי הנחישות של תא T תת קבוצה ספציפית alloproliferation. אחת הדרכים לשפר את היישום הקליני של גישת האסטרטגיה שלנו יהיה לפתח לאמת assay של alloreactivity זה לוקח רק כמה שעות כדי לבצע אשר יכול להתבצע לפני שחרורו של תאים alloanergized לשימוש קליני.</p><p class="jove_content"> בנוסף הוכחת efficiacy האסטרטגיה חשוב גם כדי לאשר את תהליך alloanergization סגוליות. זה יכול להיעשות בקלות על ידי קביעה של שימור היחסי של alloresponses ספציפית allostimulators צד שלישי כאשר CMV-reactive תאים התורם נמצאים alloanergized, על ידי שמירה על התגובות שגשוג ל-CMV</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Human AB serum (heat inactivated)	Gemini Bio-Products	100-512	Use validated batches
Complete Culture Media (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator	GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps	Corning, Inc.	3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies			See protocol text
U bottomed 96 well culture plates	BD Labware	353077
Monoclonal CD3 antibody	Beckman Coulter	IM0178	Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody	Beckman Coulter	IM1376	Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen	Microbix	EL-01-02
Tritiated Thymidine	NEN	NET027
Scintillation Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Printed Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filter Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter	Wallac