Summary
本文介绍了一个微米尺度上的贴壁细胞,细胞与细胞之间的相互作用的动态监管的实验方法。肝细胞和基质细胞之间的连接通讯的操纵表现。开发的平台,使细胞间的相互作用在多种生物学过程,包括开发和发病机制的调查。
Abstract
细胞微环境的作用是公认的在确定在几乎所有的哺乳动物组织中,从开发到恶变细胞的命运和功能至关重要。在众多的生物现象,特别是与邻国间质的相互作用被牵连,但是,传统技术的能力受到限制,询问这种相互作用的空间和动态元素。
在微机械可重构文化(RC),我们采用运动部件,以动态控制细胞间的相互作用,通过机械的重新定位一个微加工硅衬底此前,该方法已应用于调查在联合培养的肝细胞和非实质细胞间的沟通,表现出随时间变化的相互作用和有限的范围内为1可溶性信号。
在这里,我们详细描述了RC系统的编制和使用。我们首先证明处理使用镊子,包括之间的差距和触点配置驱动装置的零件(细胞群相隔一条狭窄的80微米的差距,或直接的亲密接触)。接下来,我们详细基板准备文化的过程,多步的细胞种植过程中获得融合细胞单层。使用实时显微镜,我们再说明实时操纵细胞之间的不同可能的实验配置。最后,我们展示了,需要重新重用的设备表面的步骤:甲苯和食人鱼清洁,聚苯乙烯涂层,氧等离子体处理。
Protocol
细胞培养制备:
- 开始涂硅等离子体处理聚苯乙烯部分。
- 适当的细胞外基质蛋白的外衣部件,以支持所需的细胞类型的附件。肝细胞,孵育50μg/ ml的胶原蛋白1的溶液,在37 ° C为45分钟。 3T3成纤维细胞,没有矩阵是必要的。
- 锁定部分相辅相成的部分接触配置。
- 70%的乙醇中浸泡至少10分钟进行消毒。在细胞培养基冲洗DDH 2 O和1X 2X。
- 在适当的培养基中的浓度在50万细胞/ ml的种子细胞。使用1毫升每孔12孔培养板。
- 孵育1小时,每15分钟摇动重新悬浮细胞均匀。
- 如果一个汇合单层尚未实现1小时后,吸新鲜悬浮细胞悬液和重复播种。重复,直到所需的细胞密度已经达到。
- 删除相辅相成的部分。转让部分新鲜井和孵育过夜,让细胞充分坚持和传播。
- 合作形式的文化锁定差距或接触配置适当部位。在任何文化过程中所需的配置可能会改变。
- 当变化的媒体,照顾离开细胞干尽可能少的时间,最好是一两秒钟。一方面抽出液,并立即更换媒体使用另一方面。
进行再利用处理芯片部分:
- 地带浸泡在漂白剂的细胞,并用清水漂洗。
- 允许部分完全干燥。在甲苯中浸泡2小时地带聚苯乙烯。
- 清洁食人鱼溶液(1:2 H 2 O 2:H 2 SO 4)加热到120 ° C
- 下冲洗15分钟连续流动的DDH 2 O如果你不打算立即存款聚苯乙烯,存储在水中的部分。
- 溶解在甲苯在100毫克/毫升的聚苯乙烯。聚丙烯锥形涡约1小时,或直至完全溶解。每10个部分需要多一点溶液。
- 旋涂聚苯乙烯为30秒,在2400 rpm的个人硅部分解决方案。
- 在120 ° C烘烤至少5小时
- 用1分钟的氧等离子体(200毫托,200瓦)处理。
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Discussion
这个系统是独一无二的,它使组织的空间组织,在细胞水平上进行动态操纵。因此,该设备已启用新型生物实验,跨间信令动态,介导的接触与可溶性信号,细胞命运的决定,毒理学,和蜂窝串扰等主题。此装置应在广泛普及,因为文化基板,是标准的组织培养塑料,并与标准培养方法和检测系统是兼容的。因此,我们相信,这个平台将作为一个在许多不同的细胞和组织细胞 - 细胞相互作用研究的工具的广泛兴趣。
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Acknowledgments
作者感谢在此设备的设计过程中的有益的讨论萨尔曼Khetani,贾里德 - 阿伦,克里斯Flaim和奥斯汀Derfus。这项工作是由美国国家科学基金会教师早期职业发展计划,国家卫生/国立糖尿病,消化道和肾脏疾病研究所研究院,大卫和露西尔帕卡德基金会的支持。英皇酒店是由一个露丝属Kirschstein国家研究服务奖的支持。
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Silicon Comb Substrates | Tool | N/A | N/A | Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu). |
References
- Hui, E. E., Bhatia, S. N.
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