Utilisez des fluorescents Immuno-Chimie pour la détection de Edwardsiella ictaluri Dans la barbue de rivière ( I. punctatus) Des échantillons
Summary
Nous décrivons ici une procédure permettant à l'étiquetage des<em> Edwardsiella ictaluri in situ</em> Dans les coupes histologiques de la barbue de rivière<em> Ictalurus punctatus</em> Par immunohistochimie indirecte avec des anticorps monoclonaux ED9 comme un primaire, et les lampes fluorescentes FITC anticorps marqués comme secondaire. Cela a permis la détection de la bactérie en utilisant la microscopie à fluorescence.
Abstract
Bien Edwardsiella ictaluri est un pathogène majeur des barbue de rivière Ictalurus punctatus et a été découvert près de trois décennies 1,2, jusqu'à présent, à la connaissance de ces auteurs, aucune méthode n'a été développée pour permettre la visualisation in situ de la bactéries dans les coupes histologiques.
Alors que la localisation bactérienne a été déterminée in vivo dans des études précédentes utilisant un décompte plaque 3, 4 radiométrique étiquetés ou bactéries bioluminescentes 5, la plupart de ces études ont été menées uniquement au niveau des organes brut, avec une exception 6. Cette limitation est particulièrement préoccupante car E. ictaluri a un cycle d'infection complexes 1,7, et il a une variété de facteurs de virulence 8,9. L'interaction complexe de E. ictaluri avec son hôte est similaire à bien des égards à Salmonella typhi 10, qui est dans la même famille taxonomique.
Nous décrivons ici une technique permettant la détection de bactéries à l'aide indirecte d'immuno-histochimie en utilisant l'anticorps monoclonal ED9 d'anticorps décrits par Ainsworth et al. 11.
En bref, un sérum de blocage est appliqué à paraffine coupes histologiques pour empêcher les non-spécifiques Biding. Ensuite, les coupes sont incubées avec l'anticorps primaire: E. ictaluri anticorps monoclonal spécifique ED9. Anticorps en excès sont rincés et les anticorps marqués FITC secondaire sont ajoutés. Après rinçage, les sections sont montées avec un milieu de montage spécifiques fluorescents.
Cela a permis la détection de E. ictaluri in situ dans des coupes histologiques de tissus barbue de rivière.
Protocol
Discussion
Ce protocole décrit une technique pour la visualisation in situ de l'silure pathogène Edwardsiella ictaluri dans les coupes histologiques. Pour le meilleur de notre connaissance, c'est le premier protocole décrit par exemple.
L'étape la plus critique, dans notre expérience, est le rinçage de l'anticorps tel que décrit dans l'étape 4.4 du présent protocole comme le lavage insuffisant peut entraîner des faux positifs.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner l'aide technique de Banes Michelle ainsi que le Dr Petrie-Hanson, Eels Dr et Timothy Brown pour leur aide en développement et l'exécution des immunohistochimie. Ce projet a été financé par l'USDA CRIS projet # MISV-0801310 et par la Mississippi State University College de Médecine Vétérinaire.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Brain Infusion broth | Becton Dickinson | 237200 |
| MS222 | Argent Labs | |
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 |
| Goat anti-mouse FitC | Southern Biotech | 1010-04 |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P-4504 |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 85040C |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma | P-5379 |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S-5761 |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma | S-9625 |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma | S-9390 |
References
- Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. . Fish Pathology. , (2001).
- Lawrence, M. L. . Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
