L'uso di Immuno-fluorescenza Chimica per il rilevamento di Edwardsiella ictaluri In pesce gatto di canale ( I. punctatus) I campioni
Summary
Qui si descrive una procedura che consenta l'etichettatura dei<em> Edwardsiella ictaluri in situ</em> In sezioni istologiche di pesce gatto di canale<em> Ictalurus punctatus</em> Utilizzando l'immunoistochimica indiretta con anticorpi monoclonali Ed9 come anticorpi FITC primario, e fluorescenti etichettato come secondario. Questo ha permesso per la rilevazione del batterio usando la microscopia a fluorescenza.
Abstract
Mentre Edwardsiella ictaluri è un patogeno importante canale di pesce gatto Ictalurus punctatus ed è stato scoperto quasi tre decenni fa 1,2, finora, per quanto a conoscenza di questi autori ', nessun metodo è stato sviluppato per consentire la visualizzazione in situ della batteri in sezioni istologiche.
Mentre la localizzazione batterica è stata determinata in vivo negli studi precedenti con conta piastra 3, radiometriche etichettati 4 o batteri bioluminescenti 5, la maggior parte di questi studi sono stati condotti solo a livello di organo lordo, con una sola eccezione 6. Questa limitazione è particolarmente preoccupante perché E. ictaluri ha un ciclo complesso infezione 1,7, ed ha una varietà di fattori di virulenza 8,9. La complessa interazione di E. ictaluri con il suo ospite è simile per molti aspetti a Salmonella typhi 10, che si trova nella stessa famiglia tassonomica.
Qui si descrive una tecnica che permette per la rilevazione di batteri utilizzando indiretto immunoistochimico utilizzando l'anticorpo monoclonale Ed9 descritto da Ainsworth et al. 11.
In breve, un siero blocco viene applicato paraffina sezioni istologiche incorporato per prevenire non specifici aspettando. Poi, le sezioni vengono incubate con l'anticorpo primario: E. ictaluri anticorpo monoclonale specifico Ed9. Anticorpi in eccesso vengono risciacquati via e la FITC anticorpi marcati secondari vengono aggiunti. Dopo il risciacquo, le sezioni sono montate con una fluorescente medio di montaggio specifiche.
Questo ha permesso per la rilevazione di E. ictaluri in situ in sezioni istologiche di tessuti pesce gatto di canale.
Protocol
Discussion
Questo protocollo dettagli di una tecnica per la visualizzazione in situ del patogeno pesce gatto Edwardsiella ictaluri in sezioni istologiche. Per quanto a nostra conoscenza, questo è il primo protocollo come descritto.
La fase più critica, nella nostra esperienza, è il risciacquo degli anticorpi, come descritto nel passaggio 4.4 del presente protocollo come il lavaggio insufficiente può portare a falsi positivi.
Il problema principale con …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere l'assistenza tecnica di Banes Michelle e Petrie-Hanson, Eels e il Dott. Timothy Brown, per la loro assistenza sviluppare ed eseguire il immunoistochimica. Questo progetto è stato finanziato dalla USDA CRIS progetto # MISV-0801310 e dal Mississippi State University College di Medicina Veterinaria.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Brain Infusion broth | Becton Dickinson | 237200 |
| MS222 | Argent Labs | |
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 |
| Goat anti-mouse FitC | Southern Biotech | 1010-04 |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P-4504 |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 85040C |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma | P-5379 |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S-5761 |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma | S-9625 |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma | S-9390 |
References
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