מבחני photobleaching (FRAP & FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים
Summary
אנו מתארים שיטות photobleaching כולל שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) והפסד הקרינה photobleaching (FLIP) כדי לעקוב אחר הדינמיקה חלבון הכרומטין בתוך גזע עובריים (ES) התאים. הכרומטין הדינמיקה חלבון, אשר נחשב אחד האמצעים ללמוד פלסטיות הכרומטין, מוגברת בתאים pluripotent.
Abstract
שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) והפסד הקרינה photobleaching (FLIP) לאפשר את לימוד הדינמיקה חלבון בתאים חיים עם רזולוציה במרחב ובזמן טוב. כאן אנו מתארים כיצד לבצע FRAP מבחני FLIP של חלבונים הכרומטין, כולל H1 ו HP1, בעכבר גזע עובריים (ES) התאים. בניסוי FRAP, תאים transfected, או transiently או ביציבות, עם חלבון של עניין התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או נגזרים ממנו (YFP, CFP, שרי וכו '). ב, תאים transfected fluorescing, קרן לייזר ממוקדת הלבנה אינטנסיבי באזור קטן יחסית של עניין (ROI). אורך גל לייזר נבחרה על פי חלבון פלואורסצנטי המשמש היתוך. אור לייזר בלתי הפיך הלבנה אות הניאון של מולקולות ROI ו, מיד לאחר הלבנה, ההתאוששות של האות ניאון באזור מולבן – מתווכת על ידי החלפתו של מולקולות מולבן עם מולקולות מולבן – מנוטר באמצעות לשגות הדמיה הזמן. עקומות שנוצר התאוששות הקרינה לספק מידע על ניידות של החלבון. אם מולקולות ניאון הם נייח, ההחלמה לא הקרינה יקויימו. בגישה משלים, אובדן הקרינה photobleaching (FLIP), קרן הלייזר הלבנה באותו מקום שוב ושוב את עוצמת האות נמדדת במקום אחר בתא fluorescing. ניסויים FLIP ולכן למדוד דעיכה אות ולא התאוששות פלואורסצנטי מועילים כדי לקבוע ניידות חלבון, כמו גם חלבון מדלג בין תאים סלולריים. מחייב חלוף הוא רכוש משותף של הכרומטין הקשורים חלבונים. אמנם חלק גדול של כל חלבון הכרומטין חייב הכרומטין בכל רגע נתון על מצב יציב, מחייב הוא חולף וחלבונים הכרומטין ביותר יש תחלופה גבוהה על הכרומטין, עם זמן מגורים בסדר גודל של שניות. מאפיינים אלה הם קריטיים ליצירת גמישות גבוהה בביטוי הגנום 1. ניסויים photobleaching ולכן הם יעילים במיוחד כדי לקבוע פלסטיות הכרומטין באמצעות GFP-Fusion גירסאות של חלבונים מבניים הכרומטין, במיוחד בתאי גזע עובריים, שם החליפין הדינמי של חלבונים הכרומטין (כולל חלבון heterochromatin 1 (HP1), היסטון H1 מקשר ו ההיסטונים הליבה) גבוה מ בתאים הבדיל 2,3.
Protocol
Discussion
שלא כמו בשיטות הזמינות ביותר, אשר כרוך הכרומטין מטוהרים מן אוכלוסיות תאים או תאים קבוע, ניסויים FRAP בעקבות שינויים הדינמיקה חלבון הכרומטין בתאים חיים. מצאנו הדינמיקה הכרומטין חלבון להיות אינדיקטור טוב עבור פלסטיות הכרומטין. עם זאת, מכיוון שהיא דורשת פיוזינג את הגן של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדה משורר, במיוחד שי מלצר, עדי Alajem, Edupuganti ראגו רם, באדי סרי Sailaja, אנה Mattout ואלווה בירן, הערות ביקורתיות עבור בעיות הירי ניסויים photobleaching על בסיס יומי. EM מהווה ח ר 'יוסף בל בראון מרצה בכיר למדעי החיים והוא נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (ISF 943/09), את משרד הבריאות (6007) האיחוד האירופי (IRG-206872 ו 238176), למלחמה בסרטן Research Foundation, מענקים פנימי רפואי יישומי של האוניברסיטה עברית ואת הפסיכו המכון הישראלי.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5671 |
| Gelatin | Merck | 1.04078 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
References
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E., Girard, L. . Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).
- Meshorer, E. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. . Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).
- Dundr, M., Misteli, T. Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).
- Ellenberg, J. Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).
- Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus. Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).
- Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know. Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).
- Poser, I. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Sigal, A. Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells. Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).
- Cohen, A. A. Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug. Science. 322, 1511-1516 (2008).
