Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias
Summary
Se describen los métodos de photobleaching incluyendo recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) para controlar la dinámica de la cromatina de proteínas en células madre embrionarias (ES) las células. Dinámica de la cromatina proteína, que es considerado como uno de los medios para estudiar la plasticidad de la cromatina, es mayor en las células pluripotentes.
Abstract
La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) permiten el estudio de la dinámica de proteínas en las células vivas con una buena resolución espacial y temporal. Aquí se describe cómo llevar a cabo ensayos FRAP y FLIP de proteínas de la cromatina, como H1 y HP1, en madre embrionarias de ratón (ES) las células. En un experimento FRAP, las células son transfectadas, ya sea transitoria o estable, con una proteína de interés fusionada con la proteína verde fluorescente (GFP) o sus derivados (YFP, PPC, cerezo, etc.) En las células transfectadas, fluorescentes, un intenso haz de láser enfocado blanqueadores una región relativamente pequeña de interés (ROI). La longitud de onda se selecciona de acuerdo a la proteína fluorescente utilizado para la fusión. La luz del láser irreversiblemente blanquea la señal fluorescente de moléculas en el retorno de la inversión, e inmediatamente después de blanqueo, la recuperación de la señal fluorescente en la zona blanqueada – mediado por la sustitución de las moléculas de blanqueado con las moléculas de crudo – se vigila por medio de imágenes de lapso de tiempo. Las curvas de fluorescencia generada recuperación de proporcionar información sobre la movilidad de la proteína. Si las moléculas fluorescentes son inmóviles, no hay recuperación de fluorescencia se observó. En un enfoque complementario, la pérdida de fluorescencia photobleaching (FLIP), el rayo láser blanquea el mismo lugar varias veces y la intensidad de la señal se mide en otras partes de la célula de fluorescencia. Experimentos FLIP por lo tanto, medir la descomposición de la señal en lugar de la recuperación de la fluorescencia y son útiles para determinar la movilidad de proteínas, así como proteínas y venir entre los compartimentos celulares. Unión transitoria es una característica común de las proteínas asociadas a la cromatina. Aunque la mayor fracción de cada proteína de la cromatina se une a la cromatina en un momento dado en el estado estacionario, la unión es temporal y la mayoría de las proteínas de la cromatina tienen una alta rotación en la cromatina, con un tiempo de residencia en el orden de segundos. Estas propiedades son cruciales para la generación de alta plasticidad en la expresión del genoma 1. Photobleaching experimentos son particularmente útiles para determinar la plasticidad de la cromatina mediante la fusión GFP-versiones de la cromatina proteínas estructurales, especialmente en las células madre embrionarias, donde el intercambio dinámico de las proteínas de la cromatina (incluyendo la proteína de heterocromatina 1 (HP1), la histona H1 y enlazador histonas) es mayor que en las células diferenciadas 2,3.
Protocol
Discussion
A diferencia de la mayoría de las técnicas disponibles, que incluyen la cromatina purificada a partir de poblaciones de células o células fijadas, los experimentos FRAP seguir los cambios en la dinámica de las proteínas de la cromatina en las células vivas. Encontramos dinámica de la cromatina proteínas para ser un buen indicador de la plasticidad de la cromatina. Sin embargo, debido a que requiere la fusión del gen de interés con las buenas prácticas agrarias, la adición de la etiqueta fluorescente puede i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Meshorer, especialmente Shai Melcer, Alajem Adi, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Mattout Anna y Biran Alva, por comentarios críticos y ensayos de solución de problemas photobleaching sobre una base diaria. EM es una H. Joseph y Belle R. Braun Profesor titular de Ciencias de la Vida y con el apoyo de la Fundación Ciencias de Israel (ISF 943/09), el Ministerio de Salud de Israel (6007) de la Unión Europea (IRG-206872 y 238176), la Fundación para la Investigación del Cáncer de Israel, las subvenciones internas Aplicativo de Medicina de la Universidad Hebrea y del Instituto de Psicobiología Israel.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5671 |
| Gelatin | Merck | 1.04078 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
References
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