Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching
Summary
Biz Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve embriyonik kök hücreleri (ES) kromatin protein dinamiklerini izlemek için (FLIP) Photobleaching Floresan kaybı da dahil olmak üzere photobleaching yöntemleri açıklanmaktadır. Kromatin plastisite çalışma araçlarının biri olarak kabul edilir Kromatin protein dinamiği, pluripotent hücreler geliştirilmiş.
Abstract
Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve Photobleaching olarak Floresan Kaybı (FLIP) iyi mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip canlı hücrelerin protein dinamikleri çalışma sağlar. Burada sıkı bağlamak ve kromatin proteinleri, H1 ve HP1, fare embriyonik kök (ES) hücreleri de dahil olmak üzere FLIP deneyleri gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Sıkı bağlamak deneyde, hücreler, yeşil floresan protein (GFP) veya bunların türevleri (YFP, CFP, Kiraz, vb.) Ile kaynaşmış bir ilgi protein, ya geçici ya da stabil bir şekilde, transfekte vardır. Transfekte floresanlama hücreleri, yoğun bir ilgi odaklı lazer ışını nispeten küçük bir bölge (ROI) beyazlatıcılar. Lazer dalga boyu, füzyon için kullanılan floresan protein göre seçilir. Geri dönüşümsüz yatırım getirisini lazer ışığı floresan sinyal moleküllerin beyazlatıcılar ve hemen beyazlatma aşağıdaki ağartılmış alan floresan sinyal kurtarma ağartılmamış molekülleri ile ağartılmış moleküllerin yedek aracılık zaman atlamalı görüntüleme ile izlenir. Üretilen floresan kurtarma eğrileri protein hareketlilik hakkında bilgi sağlar. Floresan moleküller hareketsiz iseniz, herhangi bir floresan iyileşme görülecektir. Tamamlayıcı bir yaklaşım, Photobleaching içinde Floresan Kaybı (FLIP), lazer ışını aynı noktaya tekrar tekrar beyazlatıcılar ve başka floresanlama hücre sinyal yoğunluğu ölçülür. Bu nedenle FLIP deneyler yerine floresan kurtarma ölçmek ve sinyal çürümesi, hücresel bölmeleri arasında mekik protein hareketlilik gibi, protein belirlemek için yararlıdır. Geçici bağlanma kromatin ile ilişkili proteinlerin ortak bir özelliği. Her kromatin protein kararlı durum herhangi bir anda büyük bir bölümü kromatin bağlı olmasına rağmen, bağlama, geçici ve en kromatin proteinleri saniye sırasına göre bir ikamet süresi, kromatin üzerinde yüksek bir ciroya sahip. Bu özellikler, yüksek plastisite genom ifade 1 üretmek için çok önemlidir . Photobleaching deneyler kromatin proteinleri (heterokromatinin protein 1 (HP1), bağlayıcı histon H1 ve çekirdek histon dahil) dinamik değişimi yüksek olduğu, bu nedenle özellikle ES hücrelerinin kromatin plastisite, kromatin yapısal proteinleri, GFP-füzyon sürümlerini kullanan belirlemek için özellikle yararlı 2,3 farklılaşmış hücrelerin daha.
Protocol
Discussion
Hücre popülasyonlarının veya sabit hücreleri, sıkı bağlamak deneyler saflaştırılmış kromatin içeren en uygun teknikler, aksine, canlı hücrelerde kromatin protein dinamikleri değişiklikler izleyin. Kromatin protein dinamiği kromatin plastisite için iyi bir gösterge olarak bulundu. Ancak, bu fırınlama, GFP ilgi geninin gerektirdiğinden, floresan etiketinin yanı sıra protein fonksiyonu ile karışabilir. Bu nedenle, sıkı bağlamak geçmeden önce, füzyon proteini titizlikle kendi doğal muhatab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz kritik bir yorum ve sorun giderme günlük bazda photobleaching deneyler için, özellikle Meshorer laboratuar üyeleri, Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, badi Sri Sailaja, Anna Mattout ve Alva Biran teşekkür ederim. EM, Joseph H. ve Belle R. Braun Yaşam Bilimleri Kıdemli Öğretim Üyesi ve İsrail Bilim Vakfı (ISF 943/09), İsrail Sağlık Bakanlığı (6007) Avrupa Birliği (IRG-206.872 ve 238.176) tarafından desteklenen İsrail Kanser Araştırma Vakfı, İbrani Üniversitesi ve İsrail Psikobiyoloji Enstitüsü İç uygulamalı Tıp Hibeler.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5671 |
| Gelatin | Merck | 1.04078 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
References
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E., Girard, L. . Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).
- Meshorer, E. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. . Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).
- Dundr, M., Misteli, T. Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).
- Ellenberg, J. Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).
- Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus. Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).
- Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know. Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).
- Poser, I. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Sigal, A. Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells. Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).
- Cohen, A. A. Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug. Science. 322, 1511-1516 (2008).
