Поляризованные транслокации флуоресцентных белков в Xenopus Эктодермы в ответ на Wnt сигнализации
Summary
Xenopus эмбриональной эктодермы стала привлекательной моделью для исследования клеточной полярности. Анализа описывается, в котором субклеточных распределение флуоресцентных белков оценивается в эктодермы клеток. Этот протокол поможет решить вопросы, связанные с пространственным управления сигнализацией.
Abstract
Сотовые полярность фундаментальное свойство клеток эукариот, который динамически регулируется как внутренних и внешних факторов во время эмбрионального развития 1, 2. Один из сигнальных путей, участвующих в этом регулирование Wnt путь, который используется во много раз во время эмбриогенеза и критические для человека болезнь 3, 4, 5. Множественные молекулярные компоненты этого пути согласованно регулировать сигнализации в пространственно-ограниченной форме, но основные механизмы, полностью не поняты. Xenopus эмбриональных эпителиальных клеток является отличной системой для изучения субклеточных локализации различных сигнальных белков. Флуоресцентные белки слияния выражены у эмбрионов Xenopus путем микроинъекции РНК, эктодермального эксплантов готовятся и локализации белка оценивается epifluorescence. В этом протоколе исследования мы описываем, как субклеточные локализации Diversin, цитоплазматических белков, которые были причастны к сигнализации и клеточной полярности определения 6, 7 визуализируется в Xenopus эктодермальных клеток для изучения передачи сигналов Wnt 8. Коэкспрессия Wnt лиганда или Frizzled рецепторов изменяет распределение Diversin сливается с красного флуоресцентного белка, ППП, и новобранцы его клеточную мембрану в поляризованной моды 8, 9. Это бывший протокол естественных условиях должно быть полезным дополнением к лабораторные исследования в культивируемых клетках млекопитающих, в котором пространственные контроль сигнализации отличается от неповрежденной ткани и является гораздо более трудной для анализа.
Protocol
Discussion
Мы использовали выше протокол, чтобы охарактеризовать субклеточные локализации Diversin. В эксплантатах животных полюса, Diversin-ППП был обнаружен рядом с ядром и colocalized с г-тубулина, centrosomal маркер, в cryosections (рис. 1). После субклеточные локализации белка определяется, удаление конструкции могут…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории Сокол спонсируется Национальным Institues здравоохранения.
References
- Gurdon, J. B. Embryonic induction — molecular aspects. Development. 99, 285-306 (1987).
- Moody, S. A. . Principles of Developmental Genetics. , (2007).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Gordon, M. D., Nusse, R. Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).
- Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling. Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).
- Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).
- Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling. J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).
- Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development. Mech Dev. 74, 145-157 (1998).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, 675-686 (1982).
- Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling. J Biol. 4, 3-3 (2005).
