Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling
Summary
Xenopus embryonalen Ektoderm hat sich ein attraktives Modell für Studien der Zellpolarität. Ein Assay ist beschrieben, in denen subzellulären Verteilung von fluoreszierenden Proteinen in Ectodermzellen beurteilt wird. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, Fragen im Zusammenhang mit räumlichen Steuerung der Signalisierung.
Abstract
Zellpolarität ist eine fundamentale Eigenschaft von eukaryotischen Zellen, die dynamisch von beiden innerer und äußerer Faktoren ist während der embryonalen Entwicklung 1, 2 geregelt. Einer der Signalwege in dieser Regelung beteiligt ist, des Wnt-Signalwegs, der oft verwendet wird während der Embryogenese und entscheidend für die menschliche Krankheit 3, 4, 5. Mehrere molekularen Komponenten dieses Signalwegs koordinativ regulieren Signalisierung in einem räumlich eingeschränkten Weise, aber die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch nicht vollständig verstanden. Xenopus embryonalen Epithelzellen ist ein ausgezeichnetes System zur subzellulären Lokalisation verschiedener Signalproteine zu studieren. Fluorescent Fusionsproteine in Xenopus Embryonen, die durch RNA Mikroinjektion ausgedrückt sind, ektodermalen Explantate vorbereitet und Proteinlokalisierung wird durch Epifluoreszenz ausgewertet. In diesem experimentellen Protokoll beschreiben wir, wie subzelluläre Lokalisierung von Diversin, eine zytoplasmatische Protein, das in Signal-und Zellpolarität Bestimmung 6, 7 eine Rolle spielt visualisiert in Xenopus ektodermalen Zellen Wnt Signaltransduktion 8-Studie ist. Coexpression eines Wnt-Liganden oder ein Frizzled-Rezeptor verändert die Verteilung von Diversin mit rot fluoreszierendes Protein, RFP fusioniert und Rekruten an die Zellmembran in einer polarisierten Mode 8, 9. Diese ex vivo-Protokoll soll eine sinnvolle Ergänzung zur in vitro-Studien von kultivierten Säugetierzellen, in denen räumliche Steuerung der Signalisierung unterscheidet sich von dem intakten Gewebe und ist sehr viel schwieriger zu analysieren.
Protocol
Discussion
Wir haben die oben genannten Protokoll verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung von Diversin charakterisieren. In animalen Pol Explantate wurde Diversin-RFP neben dem Zellkern und erkannt Kolokalisation mit g-Tubulin, ein zentrosomale Marker, in Gefrierschnitten (Abbildung 1). Sobald die subzelluläre Lokalisierung eines Proteins identifiziert ist, kann das Löschen Konstrukte erzeugt werden, um festzustellen, welche Proteindomänen notwendig und ausreichend für die subzelluläre Lokalisation sind. Mit diesem Ansa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung in der Sokol-Labor wird von der National Institues of Health gefördert.
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