الاستقطاب إزفاء من البروتينات في نيون القيطم الأدمة في الاستجابة لاشارة Wnt
Summary
أصبح القيطم الجنينية الأديم الظاهر نموذجا جذابا للدراسات القطبية الخلية. وصفت والفحص ، التي يتم فيها توزيع التحت خلوية المقررة من البروتينات الفلورية في خلايا الأديم الظاهر. وسوف يساعد هذا البروتوكول تعالج المسائل المتعلقة بمكافحة المكاني للإشارات.
Abstract
قطبية الخلية هي الخاصية الأساسية للخلايا حقيقية النواة التي يتم تنظيمها بشكل حيوي على حد سواء بفعل عوامل ذاتية وخارجي أثناء التطور الجنيني 1 و 2. واحد من مسارات إشارات تشارك في هذا النظام هو الطريق Wnt ، والذي يستخدم عدة مرات خلال مرحلة التطور الجنيني والحرجة لأمراض الإنسان 3 ، 4 ، 5. المكونات الجزيئية متعددة من هذا الممر تنظيم coordinately يشير بطريقة مكانيا المقيدة ، ولكن لا يفهم الآليات الكامنة بشكل كامل. القيطم طلائي الخلايا الجنينية هو نظام ممتاز لدراسة توطين التحت خلوية من مختلف البروتينات الإشارة. يتم التعبير عن البروتينات الفلورية الانصهار في الأجنة القيطم microinjection بواسطة الحمض النووي الريبي ، مستعدون explants الأدمة ويتم تقييم الترجمة البروتين epifluorescence. في هذا البروتوكول التجريبي نحن تصف كيفية الترجمة من Diversin التحت خلوية ، وهو بروتين حشوية التي تورطت في الإشارات وتحديد الخلية القطبية 6 ، 7 هو تصور في خلايا الأدمة القيطم لدراسة Wnt نقل الإشارة 8. Coexpression ليجند Wnt أو مستقبلات Frizzled يغير توزيع Diversin تنصهر مع بروتين فلوري الأحمر ، RFP ، والمجندين لغشاء الخلية بطريقة الاستقطاب 8 و 9. ينبغي لهذا البروتوكول فيفو السابقين تكون إضافة مفيدة للدراسات في المختبر من خلايا الثدييات مثقف ، والتي تتحكم المكاني للإشارة يختلف من الأنسجة سليمة وأكثر صعوبة في تحليلها.
Protocol
Discussion
لقد استخدمنا بروتوكول أعلاه لتميز الترجمة في Diversin التحت خلوية. explants في القطب الحيواني ، تم الكشف عن Diversin – RFP بجوار النواة وcolocalized تويولين مع الجميع ، علامة centrosomal ، cryosections في (الشكل 1). حالما يتم التعرف على توطين التحت خلوية من البروتين ، يمكن إنشاء بنيات الحذف لإنشاء ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويرعى الأبحاث في المختبر من قبل المركز الإنترنت سوكول الوطنية للصحة.
References
- Gurdon, J. B. Embryonic induction — molecular aspects. Development. 99, 285-306 (1987).
- Moody, S. A. . Principles of Developmental Genetics. , (2007).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Gordon, M. D., Nusse, R. Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).
- Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling. Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).
- Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).
- Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling. J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).
- Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development. Mech Dev. 74, 145-157 (1998).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, 675-686 (1982).
- Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling. J Biol. 4, 3-3 (2005).
