Preimplantation의 배아는 세포 탈수를 일으킬 수있는 hypertonic cryoprotective 솔루션으로 배치 후 cryopreserved 수 있습니다. 평균 후, 얼음 결정 형성은 배아를 둘러싼 솔루션에 유도합니다. 배아가 천천히 스토리지를위한 액체 질소로 폭락하기 전에 서브 제로 온도에 냉각로 추가 탈수가 발생합니다.
소, 양, 그리고 염소의 Preimplantation의 배아는 – 단기 또는 장기 저장을위한 cryopreserved 수 있습니다. Preimplantation의 배아 물을 주로 이루어져 및 cryopreservation 과정에서 세포내 얼음 결정 형성의 소지를 없애기는 배아 생존을 유지하기 위해 파라마운트 중요하다. 이러한 에틸렌 글리콜 (EG) 또는 세포 탈수를 용이하게 삼투 그라디언트를 만들 수 글리세롤 (GLYC)로 cryoprotective 에이전트 (CPA)의 – 태아도 hypertonic 솔루션 (1.5 M 1.4)에 배치됩니다. 배아는 CPA 솔루션의 삼투 평형에 도달 후, 그들은 개별적으로 냉동 0.25 ML 플라스틱 빨대로 hypertonic CPA 솔루션에로드됩니다. 태아도 -6 ° C.의 온도에서 제어 속도 냉장고에 넣습니다 얼음 결정 형성은 배아를 둘러싼 CPA 솔루션 유도하고, 결정은 더 탈수를 일으키는 세포, 배아 외부 공인 회계사의 농도 증가를 일으 킵니다. 배아는 액체 질소 (-196 ° C) 속으로 뛰어들었다되기 전에 -34 ° C의 온도로, 더 탈수 있도록, 0.5 ° C / 분 속도로 냉각됩니다. Cryopreserved 배아는 수신자 (대리) 여성 전송하기 전에 해동해야합니다. 배아를 포함 스트로스는 3-5 초위한 상온 공기에서 개최된 액체 질소 듀어,에서 제거하고 25-30 초위한 37 ° C의 물을 욕조에 게재됩니다. 공룡의 태아가받는 사람 (대리인) 여성 전송하기 전에 공인 회계사의 제거를위한 10 분 자당의 1 M 용액에 배치 GLYC에 cryopreserved. 배아는 EG의 cryopreserved 그러나, 직접받는 사람의 자궁으로 전송 수 있습니다.
배아는 주로 물로 이루어져 있기 때문에 preimplantation의 배아는 세포 얼음 결정 형성을 피하기 위해 본 설명 충분히 탈수 천천히 프로토콜에 따라 냉각하는 것이 중요합니다. 냉각 프로세스가 시작되면, 그것은 단방향 온도 변화를 유지하고 온도 변동을 방지하는 것이 중요합니다. 특정 CPA 솔루션에 적합한 온도에서 얼음 결정 형성 ( "시딩")의 취지는 매우 중요합니다.
이 느린 냉각 / preimplantation의 배아 cryopreservation에 대한 신속한 해동 방법에 대한 수정은 한 단계 방식 (지푸라기에 로드된 매체의 마지막 열에 자당 대신 CPA 솔루션입니다 어디에) 19 배아는 에틸렌 글리콜에 얼어 붙 어서 직접 전송 방법을 (포함 먼저 배아)에서 20 에틸렌 글리콜을 제거하지 않고 해동하고받는 여성의 자궁에 직접 전송됩니다. 에틸렌 글리콜의 볼륨을 줄이기 위해하는 것은 직접 송금 (DT)받는 여성의 자궁에 입금, 그것은 6cm가 이전에 설명한대로 계속하기 전에 매체를 가지고있는 0.25 ML 스트로우를 채우는 것이 좋습니다. 이것은 자발적인 표준 DT에 대한 cryopreserved preimplantation의 배아가 노란색 빨대에 냉동과 액화 질소 듀어에 노란색 goblets에 저장되어야한다는 상업 배아 전송 산업의 존재 것을인지해야합니다. 상업 산업도 따라야한다 모든 cryopreserved 배아의 특정 상표 요구하고 있습니다.
이 방법은 한 가지 대안은 vitrification 21보다 고농도 (6-8 M) CPA 솔루션 울트라 빠르게 CPA 솔루션 얼음없는 액체에서 "유리"상태로 변경하는 원인이 냉각 cryopreservation의 비 평형 방법입니다 크리스탈 형성. Vitrification는 증가 온도 민감도로 인해 소형 morula보다 발달 고급 아르 배아의 cryopreservation에 대한 가능성이 더 적합합니다.
연도 2008 년 이전 약 500,000 소 preimplantation의 배아 이상 55%가 cryopreserved 어디이 기술은 국제 상업 배아 전송 산업에 고유한 germplasm 자원 22 보전 신청,뿐만 아니라있다. 23
The authors have nothing to disclose.
일부 자금은 USDA 다중 상태의 연구 프로젝트에서 W는 – 2171는 "가축의 개선을위한 배아 세포와 엠브료 개발 및 조작은"기꺼이 인정받고 있습니다. 이 문서의 비디오 부분에 대한 기술적인 그림을 준비 라이언 칼라,의 예술적 재능도 기꺼이 인정하고 있습니다.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
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BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
ViGro thaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
SYNGRO Holding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco’s phosphate buffered saline |
BioLife BSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
BioLife antibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
BioLife trypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
Name of the equipment | Company | Catalog number | Comments (optional) |
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Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |