Криоконсервация Предимплантационная Эмбрионы крупного рогатого скота, овец и коз

Summary

Предимплантационная эмбрионы могут быть криоконсервированных после размещения в гипертонический раствор криопротекторных вызывать сотовых обезвоживание. После уравновешивания, ледовые образования кристаллов индуцируется в решении окружающих эмбрион. Дальнейшее обезвоживание происходит, как эмбрион медленно охлаждается до отрицательных температур до погружения в жидкий азот для хранения.

Abstract

Предимплантационная эмбрионов крупного рогатого скота, овец, коз и может быть криоконсервированных для краткосрочного или долгосрочного хранения. Предимплантационная эмбрионы состоят преимущественно из воды, и избежании внутриклеточное образование кристаллов льда при криоконсервации процесс имеет первостепенное значение для поддержания жизнеспособности эмбриона. Эмбрионы помещаются в гипертонический раствор (1,4 – 1,5 М) криопротектор (CPA), таких как этиленгликоль (ЭГ) или глицерин (GLYC) для создания осмотического градиента, что облегчает сотовых обезвоживание. После эмбрионы достигают осмотического равновесия в решении CPA, они индивидуально загружалась в гипертонический раствор ВМС в 0,25 мл пластиковые соломинки для замораживания. Эмбрионы помещаются в морозильную камеру контролируемой скорости при температуре -6 ° C. Лед образования кристаллов индуцируется в решении CPA окружающих эмбрион, и кристаллизация приводит к увеличению концентрации CPA вне эмбриона, что приводит к дальнейшему сотовых обезвоживание. Эмбрионы охлаждали со скоростью 0,5 ° С / мин, что позволяет дальнейшее обезвоживание, при температуре до -34 ° C, прежде чем погрузился в жидкий азот (-196 ° C). Криоконсервированных эмбрионов должно быть талой до передачи получателю (суррогатные) женщин. Соломка содержащих эмбрионы удаляются с жидким азотом сосуд Дьюара, который состоялся в комнате температура воздуха от 3 до 5 сек, и помещается в 37 ° С водяной бане в течение 25 до 30 сек. Эмбрионы криоконсервированных в GLYC помещаются в 1 М растворе сахарозы в течение 10 мин для удаления ВМС до перевода получателю (суррогатные) женщин. Эмбрионы криоконсервированных в EG, однако, могут быть непосредственно переданы в матку реципиента.

Protocol

1. Оценка пригодности для криоконсервации эмбрионов 1 Образцы собраны из половых путей женщины индивидуальных доноров должны быть помещены в изотоническом эмбриона среда для проведения за 10 минут до оценки с использованием стереомикроскопа. Будьте уверены, чтобы сохранить эмбрионов от каждого донора женщины отдельно друг от друга, чтобы можно было установить происхождение эмбриона потомство передачи. Использование малом увеличении (≤ 10 раз), образцы из отдельных женщин донора должны быть разделены на отдельные группы, состоящие из неоплодотворенных яйцеклеток, вырожденные эмбрионов, или передаче эмбрионов качества. Только качество класса 1 или 2 эмбрионов на компактные морулы через расширение этапах развития бластоцисты подходят для криоконсервации, а все остальные должны быть отброшены (если синхронную женщин получателя доступны для качества 3-м классе эмбрионов и после передачи беременности скоростью около 25 -30% считается приемлемой). Проверьте качество класса 1 и 2 компактные морулы через расширение эмбрионов стадии бластоцисты при увеличении ≥ 50 раз, чтобы убедиться, что зона pellucida зародыша не поврежден и что нет материала (например, клеток, слизи) придерживаясь зона pellucida. Любой эмбрион с трещинами или отсутствует зона pellucida или зона pellucida имеющих приверженцем материалы должны быть отделены от других эмбрионов и либо быть уничтожены или обработаны по отдельности. 2. Стиральная эмбрионов для уменьшения вероятности передачи заболевания 2 Перемещение зона pellucida-нетронутыми эмбрионов в минимальном объеме изотонического эмбриона проведения среду в первой скважины эмбриона промыванием (например, фосфатно-солевым буфером дополнены антибиотиков и бычий сывороточный альбумин, новорожденных телячьей сыворотки или поливинилового спирта). Держите эмбрионов от каждого донора женщины отдельно, и не пытайтесь мыть более 10 эмбрионов в одно время. Перемещение эмбрионов в минимальном объеме среды в каждой последующей стирки для достижения серийного разведения ≥ 1:100, и быть уверенным, использовать стерильную эмбриона обработки советы, которые изменились между каждой последующей стирки. Перемещение через эмбрионов еще 4 моет, как описано в пункте 2.1. Если заражения вирусными заболеваниями вызывает беспокойство, мыть эмбрионов два раза в 0,25% раствора трипсина, в общей сложности общее время воздействия трипсина не более 90 секунд. После двух моет трипсина, мыть эмбрионов в 5 раз больше в зародыше стиральной среду, как описано в пункте 2.1. После последней промывки зародыша, эмбриона место в изотонический эмбриона проведение среды. 3. Кондитерские эмбрионов Криоконсервация До 3 Эмбрионы должны быть переданы в минимальном объеме изотонического среда проведения эмбриона в гипертонический раствор (1,4-1,5 Молярная концентрация) криопротектор (CPA), таких как этиленгликоль или глицерин. Разрешить эмбрионов, чтобы сидеть в морозную среду (гипертонический раствор CPA), пока не достигнут осмотического равновесия. Поскольку этиленгликоль пронизывает эмбриональные клетки быстрее, чем глицерин, уравновешивание раз, как правило, меньше эмбрионов в этиленгликоль (5 мин), чем в глицерин (10 мин). Часть этого времени равновесие может быть достигнуто во время и после эмбрионов загружаются в соломинки (описанные в следующем шаге). 4. Загрузка Эмбрионы в 0,25 Солома Пластиковые мл для криоконсервации Приложите конец ватный тампон из 0,25 мл пластиковых соломы (11,5 см рабочую длину), чтобы устройство загрузки эмбриона, и аспирата около 1,3 см гипертонический раствор ВМС в соответствующую маркировку соломы. Различные процедуры маркировки существует, в том числе использование этикетки прикреплены к любой плагин уплотнения соломы или другой соломы связано с соломой адаптера. Удалить из соломы решение CPA, и аспирата примерно 0,15 см воздуха для создания крошечных воздушных пузырьков внутри соломой. Аспирируйте одного эмбриона в примерно 0,8 см гипертонический раствор ВМС в соломе. Удалить из соломы решение ВМС и аспирации примерно 0,15 см воздуха, чтобы создать второй крошечный пузырек воздуха в пределах соломы (пузырьки воздуха служат для физически изолировать эмбрион в течение соломы). Аспирируйте примерно 9,1 см раствора CPA, чтобы полностью заполнить соломы, будучи уверенным, чтобы привлечь в достаточном объеме раствора CPA, чтобы увлажнить поливинилхлорида (ПВХ) порошок, который существует в конце ватный тампон из соломы. Решение CPA причины порошка ПВХ в гель и печатью, что конец соломы. Печать другом конце соломы с ПВХ порошок, пластмассовые пробки уплотнения соломы, или тепло герметик. 5. Размещение Эмбрионы в контролируемой машины эмбрионов Замораживание Оценить Либо ванны метанол или жидкие машин парах азота замораживания может быть запрограммирован для криоконсервации эмбрионов предимплантационной. Нагрузка соломинки содержащие Эмбри ОС в замораживании машину, температура которого была охлаждена от температуры окружающей среды до -6 ° С. Нагрузка соломинки ватный тампон в конечном итоге (если пластик соломы герметичные заглушки или соломы адаптеров используются, и в этом случае ватный тампон конце помещается вниз). Разрешить эмбрионов сидеть при этой температуре не менее 2 минут перед началом работы. 6. Посев Как только эмбрионы не остынет до -6 ° C, используйте щипцы переохлажденного в жидкий азот (или хлопка наконечником палки, погруженной в жидкий азот), чтобы вызвать образование кристаллов льда в решении CPA внутри соломой, касаясь щипцы (или хлопка наконечником палки) на колонку раствора выше или ниже эмбриона. Воды в растворе ВМС будет кристаллизоваться в регионе воздействию жидкого азота, а кристаллы льда будет распространяться на колонке решение CPA непосредственно вокруг эмбриона. Держите эмбрионов при посеве температуре в течение 10 минут перед дальнейшим охлаждением. 7. Продолжая обезвоживание эмбрионов Прохладный эмбрионов со скоростью 0,5 ° С / мин до температуры -34 ° C. Это скорость охлаждения важно для обеспечения постоянного обезвоживания эмбриона. Держите эмбрионов на -34 ° С в течение 10 минут перед погружением эмбрионов в жидком азоте (-196 ° C). Место криоконсервированных эмбрионов в соответствующей маркировкой кубок (с жидким азотом), подключенных к соответствующим ярлыком тростника, и место тростника в канистру жидким азотом сосуд Дьюара для короткого или длительного хранения. 8. Размораживание криоконсервированных эмбрионов Вытяните канистру в шею жидким азотом сосуд Дьюара, гарантируя, что канистра остается ниже промерзания в сосуд Дьюара. Найдите тростника содержащие эмбриона можно разморозить, а также быстро и осторожно удалите соломы из кубка, будучи заведомо не теплый других соломинку в бокал. Держите соломы на воздухе в течение 3-5 секунд (для снижения заболеваемости трещины зона pellucida 4), ​​а затем погружаться в 37 ° С водяной бане в течение дополнительных 25-30 секунд. Удалить из соломы водяной бане, протрите соломы (будьте осторожны, чтобы не размазать эмбриона идентификации на соломе), использование соломы резки отхватить без ватный тампон конце соломы (если запечатанных с использованием тепла или ПВХ порошок ), или осторожно удалите пластиковую крышку уплотнения, и либо: нагрузки солому в устройство переноса эмбрионов и передачу как можно быстрее, чтобы синхронных получателя эмбриона (но только если эмбрион криоконсервированных использовании этиленгликоля как CPA), или провести открытый конец соломы на блюдо с 1,0 Молярная концентрация сахарозы (без пронизывающей соединения), а также использовать ножницы, чтобы отрезать конец ватный тампон из соломы. Содержание солома должна свободно течь в растворе сахарозы, но нажатия небольшой столб воздуха через соломинку может потребоваться, если какой-либо остаточной среде существует внутри соломой. Разрешить эмбрионов оставаться в растворе сахарозы в течение 10 минут, а затем передать эмбрионов в изотонический эмбриона проведения среду в течение 10 минут. Оценка эмбрионов после оттепели, загрузить в новой соломы, и трансфер в подходящих женщин получателя. 9. Представитель Результаты: Целый ряд факторов может повлиять на беременность и жить рождаемости в результате перевода замороженных размороженные эмбрионы предимплантационной синхронной женщин получателя 5. Эмбрионы на стадии развития менее развитых, чем компактные морулы или более продвинутыми, чем расширил бластоцисты часто не выживают криоконсервации процесса, а также эмбрионов на компактные морулы, ранние бластоцисты, бластоцисты, и расширил бластоцисты стадиях эмбрионального развития. Эмбрионы качества класса 1 и 2 дают более высокий пост-оттаивания наступления беременности, чем качество эмбрионов 3-й степени (который обычно не криоконсервированных из-за низкой ставки-оттаивания беременности). Эмбрионы неправильно во время замораживания эмбрионов или эмбриона оттаивания процедуры, скорее всего, проявлять сниженным ставкам беременности. Эмбрионы передается получателю женщин которого эстрального цикла не синхронизированы с донорской женщины обычно производят более низкие ставки беременности. Эмбрионы производятся в пробирке или каким-то образом (например, биопсии или пополам) обычно дают более низкие ставки беременности. При оптимальных условиях, частота наступления беременности, полученные после перевода замороженных талых в естественных производных эмбрионов, как правило, 60-70% у крупного рогатого скота 6,7, 65-75% у овец 8,9,10,11, и 60-70% у коз 12,13,14,15. Аналогичным образом, частота наступления беременности, полученные после перевода замороженных талых в пробирке эмбрионы производятся, как правило, 40-50% у крупного рогатого скота 6,16, 25-35% у овец 17, и 30-40% у коз 18. BLE 1 "/> Таблица 1. Ожидаемая частота наступления беременности после перевода замороженных-размороженные эмбрионы из отечественных видов жвачных животных в синхронных женщин получателя.

Discussion

Поскольку эмбрионы состоят преимущественно из воды, очень важно, чтобы предимплантационной эмбрионов быть адекватно обезвоженной и медленно охлаждают в соответствии с протоколом, описанные здесь, чтобы избежать внутриклеточное образование кристаллов льда. После охлаждения процесс уже начался, очень важно для поддержания однонаправленного изменения температуры и избежать колебания температуры. Начало формирование кристаллов льда ("посева") в соответствующей температуры для конкретного решения CPA имеет решающее значение.

Модификации этого медленного охлаждения / быстрое таяние метод криоконсервации эмбрионов предимплантационной включают один шаг метода (где последняя колонка среднего загружаются в соломенной является сахароза, а не решение CPA) ¹⁹ и прямого метода передачи (где эмбрионы заморожены в этиленгликоль размораживают и передаются непосредственно в матку женщины получателя без предварительного удаления этиленгликоля из эмбриона) ^20. Для уменьшения объема этиленгликоля на хранение в матку прямой передачи (DT) получателя женщина, желательно, чтобы заполнить 0,25 мл соломы с 6 см проведения среду, прежде чем продолжить, как описано выше. Следует отметить, что добровольный стандарт существует в индустрии коммерческого переноса эмбрионов, что предимплантационной эмбрионов для криоконсервации DT должны быть заморожены в желтый цвет соломки и хранится в желтый цвет кубки в жидкий азот дьюара. Коммерческой промышленности также имеет специфические требования к маркировке для всех криоконсервированных эмбрионов, которые должны быть соблюдены.

Один из вариантов этого метода является стеклования ^21, неравновесные методом криоконсервации, где более высокая концентрация (6-8 М) CPA раствор охлаждают ультра-быстро вызывает решение CPA изменить из жидкого состояния в "стеклянный" государство без льда образование кристаллов. Витрификация, вероятно, лучше подходит для криоконсервации эмбрионов, которые являются менее умственно развитыми, чем компактные морулы из-за их повышенной температурной чувствительности.

Этот метод имеет применение для сохранения уникальных ресурсов зародышевой плазмы ^22, а также для международных коммерческих промышленности переноса эмбрионов, где более 55% приблизительно 500.000 бычьего эмбрионов предимплантационной переданы в календарном 2008 году были криоконсервированных ^23.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments (optional)
BioLife freeze medium	Agtech, Inc.	C18, C18A	1.5 M ethylene glycol
Emcare ethylene glycol freeze solution	ICPBio Reproduction	IC8, IC10	1.5 M ethylene glycol
ViGro ethylene glycol freeze plus	Bioniche Animal Health	EVM835	1.5 M ethylene glycol
Emcare 10% glycerol freeze solution	ICPBio Reproduction	IC12	1.34 M glycerol
Emcare 1 M sucrose thaw	ICPBio Reproduction	IC16	1.0 M sucrose
ViGro one-step thaw	Bioniche Animal Health	EVM247, EVM847	1.0 M sucrose
ViGro thaw 1-2-3 plus	Bioniche Animal Health	EVM248, EVM848	5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose
Emcare CSU thawing kit	ICPBio Reproduction	IC20	6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose
BioLife holding and transfer medium	Agtech, Inc.	C15, C15A	modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin)
Emcare holding solution	ICPBio Reproduction	IC2, IC4, IC6	0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions)
ViGro holding plus	Bioniche Animal Health	EVM024, EVM824
SYNGRO Holding medium	Bioniche Animal Health	ESM024, ESM224, ESM828	contains hyaluronan; no products of animal origin
BioLife modified D- PBS	Agtech, Inc.	C06	modified Dulbecco’s phosphate buffered saline
BioLife BSA Fraction V	Agtech, Inc.	B09	lyophilized bovine serum albumin, fraction V
BioLife antibiotic-antimycotic	Agtech, Inc.	B01	amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate
BioLife trypsin kit	Agtech, Inc.	C22A	25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS

Name of the equipment	Company	Catalog number	Comments (optional)
Biol-Cool controlled rate freezer	FTS Systems	BC-IV -40	Methanol bath freezer
Freeze Control controlled rate freezer	Cryologic	CL2200	Liquid nitrogen freezer