Summary
Preimplantatorisk embryon får frysförvarade efter placering i en hyperton cryoprotective lösning för att orsaka cellulär uttorkning. När jämvikt är is kristaller bildas induceras i den lösning som omger embryot. Ytterligare uttorkning inträffar som embryot är långsamt kyls till minusgrader innan kastar sig in i flytande kväve för förvaring.
Abstract
Preimplantatorisk embryon från nötkreatur, får och getter kan frysförvarade för kort-eller långsiktig lagring. Preimplantatorisk embryon består huvudsakligen av vatten, och undvikande av intracellulära is kristaller bildas under frysförvaring processen är av största vikt att upprätthålla embryo bärkraft. Embryon placeras i en hyperton lösning (1,4 - 1,5 m) i en cryoprotective agent (CPA) som etylenglykol (EG) eller glycerol (GLYC) för att skapa ett osmotiskt lutning som underlättar cellulär uttorkning. Efter embryon nå osmotiska jämvikten i CPA lösningen, de är individuellt laddas i hyperton CPA lösningen till 0,25 ml plast strån för infrysning. Embryon placeras i en kontrollerad takt frys vid en temperatur på -6 ° C. Ice kristallbildning induceras i CPA lösningen kring embryot och kristallisering orsakar en ökning av koncentrationen av CPA utanför embryot, vilket orsakar ytterligare cellulär uttorkning. Embryon kyls med en hastighet på 0,5 ° C / min, vilket möjliggör ytterligare uttorkning, till en temperatur på -34 ° C innan det störtade ner i flytande kväve (-196 ° C). Frysförvarade embryon måste tinas innan de överförs till en mottagare (surrogat) kvinnor. Strån innehåller embryona bort från flytande kväve Dewar, som hölls i rumstemperatur luften i 3 till 5 sek, och placeras i en 37 ° C vattenbad under 25 till 30 sek. Embryon frysförvarade i GLYC placeras i en 1 M lösning av sackaros i 10 min för borttagning av CPA innan de överförs till en mottagare (surrogat) kvinnor. Embryon frysförvarade i t.ex. dock kan direkt överföras till livmodern på en mottagare.
Protocol
1. Utvärdera lämplighet embryon för Frysförvaring 1
- Prover skördats från fortplantningsorganen enskilda donerande hondjur bör placeras i en isoton embryo hålla medium för 10 minuter före utvärdering med stereomikroskop. Var noga med att hålla embryon från varje donator kvinnliga skilda från varandra för att möjliggöra identifiering av släktskap embryoöverföring avkomma.
- Använda låg förstoring (≤ 10X), bör prover från en enskild givare kvinnliga hållas åtskilda i separata grupper bestående av obefruktade ägg, degenererad embryon eller överlåtas embryon kvalitet. Endast kvalitetsklass 1 eller 2 embryon vid kompakta morula genom utökad blastocyst utvecklingsstadier lämpar sig för frysförvaring, och alla andra bör kasseras (om inte synkrona mottagare honor finns för kvalitetsklass 3 embryon och en post-överföring graviditet på cirka 25 -30% anses acceptabelt).
- Inspektera kvalitetsklass 1 och 2 kompakta morula genom utökad embryon blastocyststadiet vid en förstoring ≥ 50X för att säkerställa att zona pellucida av embryot är intakt och att det inte finns material (t.ex. celler, slem) som ansluter sig till zona pellucida. Varje embryo med en sprucken eller saknas zona pellucida eller med en zona pellucida ha vidhäftat material bör hållas åtskilda från andra embryon och antingen kasseras eller bearbetas separat.
2. Tvätt embryon för att Minska risken för överföring av sjukdomar 2
- Flytta zona pellucida-intakt embryon i en minimal volym av isoton embryo hålla mediet i den första brunnen av embryon tvätt medium (t.ex., buffrad fosfat saltlösning kompletteras med antibiotika och bovint serumalbumin, nyfödd kalv serum eller polyvinylalkohol). Håll embryon från varje donator kvinnliga separat, och försök inte att tvätta mer än 10 embryon på en gång. Flytta embryona i en minimal mängd av medelstora till varje efterföljande tvätt att uppnå en seriell spädning ≥ 1:100, och var säker att använda sterila tips embryo hantering som byts mellan varje efterföljande tvätt.
- Flytta embryon till 4 fler tvättar som beskrivs i 2.1.
- Om överföring av virussjukdomar är oroande, tvätta embryon två gånger i en 0,25% trypsin lösning, för en total sammanlagd exponeringstid till trypsin på högst 90 sekunder.
- Efter de två trypsin tvättas embryon 5 gånger mer i embryo tvätt substratet som beskrivs i 2.1.
- Efter den sista embryot tvätta, placera embryon i isoton embryo håller medium.
3. Uttorkande Embryon Före Frysförvaring 3
- Embryon skall överföras i en minimal volym av isoton embryo holding mediet till en hyperton lösning (1,4 till 1,5 Molar koncentration) av en cryoprotective agent (CPA) som etylenglykol eller glycerol.
- Låt embryon att sitta i frysa medium (hyperton CPA lösning) tills de når osmotisk jämvikt. Eftersom etylenglykol genomsyrar embryonala celler snabbare än vad glycerol, jämvikt tider är vanligtvis mindre för embryon i etylenglykol (5 min) än i glycerol (10 min). En del av denna jämviktstiden kan uppnås under och efter embryon laddas in strån (beskrivs i nästa steg).
4. Laddar embryon i en 0,25 ml plaströr för Frysförvaring
- Fäst änden bomull stickproppen till en 0,25 ml plaströr (11,5 cm arbetsbredd längd) till ett embryo lastning enheten och aspirera ca 1,3 cm av hyperton CPA-lösningen till ett korrekt märkt halm. En mängd olika märkning rutiner finns, inklusive användning av etiketter anslutning till antingen en halm tätningspluggen eller till en annan halm i samband med ett sugrör adapter.
- Ta bort halmen från CPA lösningen, och aspirera ca 0,15 cm av luft för att skapa en liten luftbubbla i halm.
- Aspirera ett enda embryo i ca 0,8 cm av hyperton CPA lösning i halm.
- Ta bort halm från CPA lösningen och aspirera ca 0,15 cm av luft för att skapa en andra liten luftbubbla i halm (luftbubblor tjänar till att fysiskt isolera embryot i halm).
- Aspirera ca 9,1 cm i CPA lösningen att helt fylla halmen, som vissa att dra in en tillräcklig mängd CPA lösning för att fukta polyvinylklorid (PVC) pulver som finns inom den bomull kontakten slutet av halm. CPA lösningen gör att PVC-pulver till gel och tätning som slutet av halm.
- Täta andra änden av halm med PVC-pulver, plast halm pluggar, eller en förslutningsmaskin.
5. Placering embryon i en kontrollerad takt Embryo Frysning Machine
- Antingen metanol bad eller flytande kväve ånga maskiner frysning kan programmeras för frysförvaring av preimplantatorisk embryon.
- Ladda strån innehåller Embry os in i en frysning maskin vars temperatur har svalnat från omgivningstemperaturen till -6 ° C. Ladda sugrör bomull kontakten hamnar (om inte plast halm pluggar eller adaptrar halm används, i vilket fall bomull kontakt änden placeras ner).
- Låt embryon att sitta vid denna temperatur i minst 2 minuter innan du fortsätter.
6. Seedning
- När embryon har svalnat till -6 ° C, använd en tång underkylda i flytande kväve (eller en bomullspinne stick nedsänkta i flytande kväve) för att inducera bildning is kristall i CPA lösningen i halmen genom att trycka på tången (eller bomull tippas hålla sig) till den kolumnen i lösningen antingen över eller under embryot.
- Vattnet i CPA lösningen kristallisera i regionen utsätts för flytande kväve, och iskristaller kommer att sprida sig till kolumnen i CPA lösning omedelbart omger embryot.
- Håll embryon vid seedning temperatur i 10 minuter innan ytterligare kylning.
7. Fortsatta Dehydrering av embryon
- Cool embryon med en hastighet på 0,5 ° C / min ned till en temperatur på -34 ° C. Detta svalningshastighet är viktigt att säkerställa fortsatt uttorkning av embryot.
- Håll embryon vid -34 ° C i 10 minuter innan kastar embryon i flytande kväve (-196 ° C).
- Placera frysförvarade embryon till en korrekt märkta bägare (fyllda med flytande kväve) bifogas en korrekt märkta sockerrör, och placera käppen in i en behållare av en flytande kväve Dewar för kort-eller långsiktig lagring.
8. Upptining frysförvarade embryon
- Dra behållaren i halsen av flytande kväve Dewar, se till att kapseln ligger under frosten rad i Dewar.
- Leta reda på sockerrör som innehåller embryot till tinas och snabbt och försiktigt ta bort halmen från den bägare, som vissa inte för att värma andra strån i pokalen.
- Håll strået i luften i 3-5 sekunder (för att minska förekomsten av en sprucken zona pellucida 4), och sedan dränka in en 37 ° C vattenbad i ytterligare 25-30 sekunder.
- Ta bort halmen från vattenbadet, torka av halm (var försiktig så du inte smutsar ned embryot identifiering på halmen), använd ett sugrör skäranordning att klippa bort den icke-bomull kontakt slutet av halm (om tätas med värme eller PVC-pulver ), eller försiktigt bort plasten tätningspluggen, och antingen:
- belastning halmen till ett embryo transfer-enhet och överföra så snabbt som möjligt till en synkron embryo mottagare (men bara om fostret var frysförvarade med etylenglykol som CPA), eller
- Håll den öppna änden av halm över en maträtt som innehåller en 1,0 Molar koncentration av sackaros (en icke-genomsyrat förening), och använd en sax för att klippa bort slutet bomull kontakten på halm. Innehållet i halm bör fritt strömma in i sackaroslösning, men driver en liten spalt av luft genom sugrör kan behövas om alla rester av medelhög finns inne i halmen. Låt embryon att stanna kvar i sackaroslösning i 10 minuter, och sedan överföra embryon i isoton embryo hålla mediet i 10 minuter. Utvärdera embryon efter upptining, ladda in i en ny halm, och transport till lämplig mottagare honor.
9. Representativa resultat:
En mängd olika faktorer kan påverka graviditeten och leva födelsetal som härrör från överföringen av frysta-tinade preimplantatorisk embryon till synkron mottagare kvinnor 5. Embryon till utvecklingsstadier mindre avancerade än kompakt morula eller mer avancerade än expanderat blastocysten ofta överlever inte frysförvaring processen liksom embryon till den kompakta morula, tidiga blastocysten, blastocysten, och utökade blastocyst stadier av embryots utveckling. Embryon av kvalitetsklass 1 och 2 ge högre efter tina priser graviditet än vad kvalitetsklass 3 embryon (som vanligtvis inte är frysförvarade grund av den låga efter tina graviditet priser). Embryon misskött under embryo frysning eller embryo tining förfaranden kommer sannolikt att uppvisa reducerade graviditet priser. Embryon till mottagare kvinnor vars Östrogencykeln är inte synkroniserat med donatorhondjuret ger oftast lägre graviditet priser. Embryon som framställts in vitro eller manipuleras på något sätt (t ex biopsier eller tudelas) ger oftast lägre graviditet priser. Under optimala förhållanden, graviditet priser som erhålls efter överföring av frysta-tinade in vivo härrör embryon är normalt 60-70% hos nötkreatur 6,7, 65-75% hos får 8,9,10,11, och 60-70% hos getter 12,13,14,15. Likaså, graviditet priser som erhålls efter överföring av frysta-tinade in vitro-producerade embryon är normalt 40-50% hos nötkreatur 6,16, 25-35% hos får 17, och 30-40% hos getter 18.
BLE 1 "/>Tabell 1. Förväntad graviditeter efter överföring av frysta-tinade embryon från tamdjur idisslare boskap till synkron mottagare honor.
Discussion
Eftersom embryon består huvudsakligen av vatten, är det viktigt att preimplantatorisk embryon vara tillräckligt uttorkad och långsamt kylas i enlighet med det protokoll som beskrivs här för att undvika intracellulära bildas is kristall. När nedkylningen har påbörjats, är det viktigt att upprätthålla enkelriktad temperaturförändringar och för att undvika temperaturväxlingar. Inledande av is kristaller bildas ("seeding") vid en lämplig temperatur för det specifika CPA lösningen är kritisk.
Ändringar i långsam kylning / snabb upptining metoden för preimplantatorisk embryo frysförvaring inkludera en-steg-metoden (där den sista kolumnen av medium laddas i halmen är sackaros istället för CPA-lösning) 19 och direkt överföring metoden (där embryona fryses i etylenglykol tinas upp och överförs direkt till livmodern av en mottagare kvinnlig utan att först ta bort etylenglykol från embryot) 20. För att minska volymen av etylenglykol sätts in i livmodern på en direkt överföring (DT) mottagaren kvinnliga, är det lämpligt att fylla 0,25 ml halmen med 6 cm hålla mediet innan du fortsätter enligt tidigare beskrivning. Det bör noteras att en frivillig standard finns inom den kommersiella embryoåterföring industri som preimplantatorisk embryon frysförvarade för DT bör frysas i gult färgade sugrör och lagras i gulfärgade pokaler i flytande kväve Dewar. Den kommersiella industrin har också särskilda krav på märkning av alla frysförvarade embryon som bör följas.
Ett alternativ till denna metod är förglasning 21, en ojämviktsmetod för frysförvaring där en mer koncentrerad (6-8 M) CPA Lösningen kyls extremt snabbt orsakar CPA lösning för att ändra från flytande till en "glasigt" tillstånd utan is kristaller bildas. Förglasning är sannolikt bättre lämpade för frysförvaring av embryon som är mindre utvecklingsmässigt avancerade än kompakt morula på grund av deras ökade temperaturkänslighet.
Denna teknik har ansökan om bevarande av unika arvsmassa resurser 22, liksom den internationella kommersiella embryoåterföring bransch där mer än 55% av de ungefär 500 tusen nötkreatur preimplantatorisk embryon under kalenderåret 2008 var frysförvarade. 23
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Delfinansiering från USDA flera stater forskningsprojektet W-2171 "könsceller och embryon utveckling och manipulation för förbättring av boskap" är tacksamt erkänns. Den konstnärliga talanger Ryan Callahan, som utarbetat tekniska illustrationer för videodelen av denna artikel, är också tacksamt erkänns.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
| ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
| Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
| ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
| ViGrothaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
| Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
| BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
| Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
| ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
| SYNGROHolding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
| BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco's phosphate buffered saline |
| BioLifeBSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
| BioLifeantibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
| BioLifetrypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
| Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
| Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |
References
- Lindner, G. M., Wright, R. W. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology. 20, 407-416 (1983).
- Stringfellow, D. A., Givens, M. D. Recommendations for the sanitary handling of in vivo derived embryos. Manual of the International Embryo Transfer Society. , 4th ed, International Embryo Transfer Society. Champaign, Illinois, USA. 65-68 (2010).
- Youngs, C. R., Leibo, S. P., Godke, R. A. Embryo cryopreservation in domestic mammalian livestock species. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources. , (2010).
- Rall, W. F., Meyer, T. K. Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos. Theriogenology. 31, 683-692 (1989).
- Spell, A. R., Beal, W. E., Corah, L. R., Lamb, G. C. Evaluating recipient and embryo factors that affect pregnancy rates of embryo transfer in beef cattle. Theriogenology. 56, 287-297 (2001).
- Hasler, J. F. The current status of oocyte recovery, in vitro embryo production, and embryo transfer in domestic animals, with an emphasis on the bovine. J. Anim. Sci. 76, Suppl 3. 52-74 (1998).
- Hasler, J. F. Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle. Theriogenology. 56, 1401-1415 (2001).
- Heyman, Y., Vincent, C., Garnier, V., Cognie, Y.
- McGinnis, L. K., Duplantis, S. C., Youngs, C. R. Cryopreservation of sheep embryos using ethylene glycol. Anim. Reprod. Sci. 30, 273-280 (1993).
- Shelton, J. N. Factors affecting viability of fresh and frozen-thawed sheep demi-embryos. Theriogenology. 37, 713-721 (1992).
- Bettencourt, E. M., Bettencourt, C. M., Silva, J. C. E., Ferreira, P., Matos, C. P., Ramão, R. J., Rocha, A. Fertility rates following the transfer of ovine embryos cryopreserved using three protocols. Small Ruminant Research. 82, 112-116 (2009).
- Chemineau, P., Procureur, R., Cognié, Y., Lefèvre, P. C., Locatelli, A., Chupin, D. Production, freezing and transfer of embryos from a bluetongue-infected goat herd without bluetongue transmission. Theriogenology. 26, 279-290 (1986).
- Baril, B., Casamitjana, P., Perrin, J., Vallet, J. C. Embryo production freezing and transfer in Angora, Alpine and Saanen goats. Zuchthyg. 24, 101-115 (1989).
- Guignot, F., Bouttier, A., Baril, G., Salvetti, P., Pignon, P., Beckers, J. F., Touzé, J. L., Cognié, J., Traldi, A. S., Cognié, Y., Mermillod, P. Improved vitrification method allowing direct transfer of goat embryos. Theriogenology. 66, 1004-1011 (2006).
- Nowshari, M. A., Holtz, W. In vitro culture of goat morulae to blastocysts before freezing. Theriogenology. 44, 983-988 (1995).
- Machatkova, M., Hulinska, P., Reckova, Z., Hanzalova, K., Spanihelova, J., Pospisil, R. In vitro production of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Veterinarni Medicina. 53, 358-364 (2008).
- Martínez, A. G., Valcárcel, A., Furnus, C. C., de Matos, D. G., Iorio, G., de las Heras, M. A.
- Han, Y., Meintjes, M., Graff, K., Denniston, R., Zhang, L., Ziomek, C., Godke, R. Caprine offspring born from fresh and frozen-thawed in vitro-produced embryos. Veterinary Record. 149, 714-716 (2001).
- Leibo, S. P. A one-step method for direct nonsurgical transfer of frozen-thawed bovine embryos. Theriogenology. 21, 767-790 (1984).
- Voelkel, S. A., Hu, Y. X. Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females. Theriogenology. 37, 687-697 (1992).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Notter, D. R. The importance of genetic diversity in livestock populations of the future. J. Anim. Sci. 77, 61-69 (1999).
- Thibier, M. Data retrieval committee statistics of embryo transfer- year 2008. The worldwide statistics of embryo transfers in farm animals. Embryo Transfer Newsletter. 27, 13-19 (2009).
