本文介绍了一种简化且准确的蚊虫血细胞采集与染色方法。该方法结合了灌注法的简便性与高精度注射技术的准确性，可分离获得埃及伊蚊（Aedes mosquitoes）中纯净的血细胞样本。本方法有助于开展需要了解血细胞类型及其丰度的相关研究。
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摘要
摘要
蚊子是多种致病病原体的传播媒介，例如黄热病病毒、疟原虫和丝虫。目前，实验室正在研究疾病传播媒介物种先天免疫系统中抗病原体的组分，希望培育出对这些病原体具有抗性的转基因蚊子1, 2。蚊子的先天免疫系统包含多道防御机制3。能够逃逸由肠上皮构成的蚊子中肠屏障的病原体4，会进入血淋巴，并与循环中的血细胞相遇；血细胞是重要的免疫细胞组分，可包裹并吞噬病原体5, 6。研究人员尚未在蚊子中发现造血组织，现有证据表明，蚊子成虫羽化时血细胞数量即已固定，且随着蚊子老化，其数量可能逐渐减少7。正确采集并鉴定具有医学重要性的昆虫血细胞，是开展细胞免疫研究的关键步骤。然而，蚊子个体微小，血淋巴体积有限，这为免疫细胞的采集带来了挑战。
收集蚊虫血细胞的两种既定方法包括从切断的喙部挤出血淋巴8，以及体积置换法（灌注法），即向头部与胸部之间的膜状颈区（即颈膜）注入生理盐水，并从腹部远端撕裂处收集灌注出的血淋巴9, 10。然而，这些方法分别存在血细胞回收率低以及可能被脂肪体细胞污染的局限性11。最近，一种称为高注射/回收的方法通过使用抗凝缓冲液，提高了免疫细胞的回收率，同时减少了鳞片和内部组织的污染水平11。尽管该方法改善了血细胞的收集与原代培养的维持，但如果下游目标仅为收集、固定和染色血细胞用于诊断，则该方法所涉及的多次注射和收集步骤并非必要。在此，我们展示了收集伊蚊（Aedes）血淋巴的方法，该方法结合了灌注法的简便性（以抗凝缓冲液替代生理盐水）与高注射技术的精确性，从而获得纯净的血细胞制备样品。
方案
1. 血细胞采集前的准备工作
- 制备一种血淋巴稀释液，包含60% Schneider's Medium、10%胎牛血清（FBS）和30%柠檬酸盐缓冲液（抗凝剂；98 mM NaOH、186 mM NaCl、1.7 mM EDTA、41 mM 柠檬酸，pH 4.5）11。分装成1.0 mL每份，可于-20°C保存。每份仅使用一次（见材料部分）。
- 使用玻璃蚀刻工具在玻璃载玻片（75 × 25 × 1 mm）一端刻出直径1 cm的圆圈以进行准备。或者，也可购买预先蚀刻有两个圆圈的显微镜载玻片（例如 Fisher Scientific 或 EMS 供应商）。每只蚊子需要一片玻璃载玻片。
- 制备一组玻璃毛细针（见材料部分），使用如下建议参数进行拉制（Sutter Instruments，型号P-87）：
加热斜坡 +5 拉力：45 速度：75 时间：175 压力：580
使用该拉针仪的建议参数，可制得总长约500 mm、针柄长约3 mm的玻璃针。也可直接购买预先拉制好的针....
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讨论
本文所述的血细胞收集方法是在先前已发表方法的基础上改进而来，能够以更少的步骤从伊蚊（Aedes）蚊虫中分离出纯净的血细胞。尽管我们的研究重点在于表征伊蚊（Aedes）蚊虫中的血细胞群体，但我们认为，在通过初步试验确定合适的注射体积后，该技术也可应用于其他蚊虫类群。本方案采用抗凝缓冲液替代生理盐水，所获得的血细胞群体可真实反映体内（in vivo）的细胞数量。然而，我们尚未确定本方案是否适用于体外培养中分离血细胞的长期维持。
通过剪断喙器采集血淋巴的方法已被证明所获得的循环血细胞数量最少，因此本文不再进一步讨论。基于灌注的方法虽然操作简便，但因容易混入内部组织和鳞片污染物而受到批评11。近年来发展出的高注射/回收方法虽可提高血细胞回收率并减少污染物含量11，但涉及多次注射和收集步骤。我们的方案在获得相同水平血细胞回收率的同时降低了污染物水平，且所需注射与收集步骤更少，因而提供了一种简便而准确的血细胞纯净制备方法。首先，本方案中将去除足、翅及腹部末端的操作在一个独立于血淋巴收集容器的环境中.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢 John Frey 和 Ben Peterson 在蚊子饲养方面提供的帮助。我们还感谢 Christine Davis 和 Gary Radice 在血细胞显微图像方面的协助。本研究由里士满大学艺术与科学暑期研究员项目资助 A. A. Qayum，以及由 A. Telang 获得的教师基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂名称 | 公司 | 目录编号 | 备注（可选） |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 染色试剂盒 | Fisher Scientific | 123-869 | |
| 玻璃毛细针（含丝硼硅酸盐） | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 外径 1.0 mm，内径 0.78 mm |
| 拉针仪 | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| 显微注射仪 | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| 持针器 | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
参考文献
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The Am....
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