Summary
一种简捷而准确的方法来收集和染色描述的蚊子血细胞。我们的方法结合灌注简单，精度高喷射技术伊蚊血细胞分离干净准备。这种方法有利于血细胞类型的研究需要的知识和它的丰富。
Abstract
蚊子是一些引起疾病的病原体，如黄热病病毒，疟原虫和丝虫的载体。实验室正在调查抗病原体的先天免疫系统产生，耐火材料等病原体1，2的转基因蚊子的希望病媒物种的组成部分。蚊子先天免疫系统由几行防御3。设法逃脱上皮内衬的蚊子中肠 4施加的障碍的病原体进入血淋巴中遇到的循环血细胞，重要的细胞成分，封装和吞噬病原体 5 ，6。研究人员还没有发现蚊子造血组织的证据，现有的证据表明，血细胞数量是固定的成虫羽化，实际数字可能下降，因为蚊子的7岁。妥善收集，并确定从医学上重要的昆虫的血细胞的能力，细胞免疫功能的研究是一个必不可少的步骤。但是，蚊子的小规模和数量有限的血淋巴构成收集的免疫细胞所面临的挑战。
两个建立的方法，包括收集蚊子血细胞血淋巴，从切割长鼻8，驱逐和位移量（灌注），其中生理盐水注入膜necklike地区之间的头部和胸部（即子宫颈癌）和灌注血淋巴收集从远端区域的腹部9，10撕裂开放。然而，这些技术是有限的，低血细胞恢复和由脂肪体细胞，分别为 11可能造成的污染。最近提到的方法使用抗凝血剂的缓冲区，以高喷射/恢复提高免疫细胞的恢复，同时减少污染规模和内部组织11水平。虽然这种方法允许收集和维持血细胞原代培养方法的改进，它需要注入和收集的步骤是没有必要的，如果下游的目标是收集，固定和染色诊断血细胞的数量。在这里，我们展示我们收集蚊子血淋巴的方法相结合的简单灌注，高喷射技术的准确性伊蚊血细胞分离干净准备，代替盐溶液中使用抗凝血剂的缓冲区。
Protocol
1。在血细胞收集提前准备
- 准备一个血淋巴稀释剂的解决方案，施耐德公司的60％中等，10％胎牛血清（FBS），和30％的柠檬酸缓冲由（抗凝血剂; 98毫米氢氧化钠，186 mM的氯化钠，1.7 mM的EDTA，41 mM的柠檬酸酸，pH值4.5） 11。设为1.0毫升分装，可在-20 ° C存储只有一次使用每个等份（见材料）。
- 准备通过计分的一端1厘米直径的圆，用玻璃蚀刻工具的玻璃显微镜载玻片（75 × 25 × 1毫米）。另外，有两个预蚀刻界的显微镜幻灯片就可以买到（如费舍尔科学或EMS来源）。蚊子的每一个玻片上，将是必要的。
- 准备一个玻璃针（见材料）拉到按照以下建议设置（萨特仪器，模型P - 87）：
热斜坡5 拉：45 VEL：75 时间：175 压力580
使用本拉马建议的设置，我们构建柄长度约3毫米的总长度约500毫米的针头。预拉的针头也可购买（如Tritech研究）。
2。提前血细胞收集在微量制备
- 根据制造商的指示，拉针插入微量持针器一个。回填微量（见材料）管，注射器和矿物油拉玻璃针根据制造商的指示。
3。雌性蚊子在血细胞收集前的准备
- 15个成年女性吸进小实体保持架可以在与冰接触的容器。浸入深度不够冰蚊子的笼子是使整个笼和各方的高度与冰的接触。这将确保所有的蚊子将被暴露在寒冷。
冷麻醉蚊子约8分钟或直到他们不再移动。 - 放置到一个抑郁症的幻灯片一个蚊子。这张幻灯片将作为注射部位。
4。血细胞集合
- 设置微量采取拉玻璃针12μL的血淋巴稀释剂注入蚊子之间的第七和第八腹节的解决方案。 3-3.5总占用量12μL液，可以注入约3蚊子。蚊子应用镊子轻轻地举行，而注射执行到位。针尖应维持在一个小体积的稀释剂，以防止被注入矿物油。注射后的腹部应该看看“填充”或臃肿。
- 地方在一个单独的干净的容器中注入蚊子在冰上5分钟恢复。孵化在蚊子体内的抗凝血剂的稀释剂的解决方案将帮助打跑坚持内部组织的血细胞。平均3至5新鲜蚊子可以注射期间每5分钟的恢复时期。
- 经过5分钟的恢复，剪断过腿，翅膀，和每个使用微型剪刀蚊子的腹部（第八部分）的一角。这项工作应在恢复杯置于冰上。切断腿和翅膀，降低被转移到收集幻灯片尺度的可能性。注：不砍腿和翅膀太接近胸附着点，或你的风险创造了血淋巴逃脱其他开口。淋巴只应收集通过在腹部末端创建开幕。
- 与70％的乙醇玻璃蚀刻显微镜幻灯片洗净，并用kimwipe。位置之一注入和回收蚀刻圈的外缘的幻灯片上的蚊子。设置微量拿起12新鲜的血淋巴稀释剂液，注入蚊子在其mesothorax侧方音量。提供最，但不是整个卷稀释剂（约8 - 10μL），以防止被注入矿物油。针尖应维持在一个小体积的稀释剂。
- 蚊子，因此，削减腹部开放1厘米的圆的边缘位置。注射后稀释血淋巴应收集标记的区域内。一旦针头从mesothoracic注射部位拆除，恢复举行蚊子两钳之间的武器，并与这些镊子轻轻挤压腹部，直接上蚀刻的圆面积的血淋巴。
- 允许稀释血淋巴干幻灯片，约10分钟，或直至它是明显的干。
5。血细胞固定和染色
- 染色每张幻灯片分别HEMA3 7（见材料）：DIP小号立德在固定液5次为1秒每次，在我的解决方案，最后浸在溶液II的幻灯片各1秒3次;各1秒的3倍Dipslide。 DI水的幻灯片冲洗背面。前面的幻灯片不应该冲洗。吸干干蚀刻圈之外，含有染色组织的幻灯片的前面。
- 围绕蚀刻中心申请安装介质（如书珥/摩或Polymount），并在其上的盖玻片。按到盖玻片（25 × 25毫米）轻微，所以，安装介质扩散到整个区域覆盖盖玻片（含染色组织包括蚀刻圈）。允许幻灯片干燥至少3小时或过夜。血细胞应被视为2个星期内，以下为最佳的可视化和成像收集。
6。代表性的成果
图1A - C的收集从埃及伊蚊成年女性的固定和HEMA3染色的血细胞的例子所示。图1A显示了我们作为基于它的体积小，球形球状的形状和高核浆比例（550X的放大倍率）11一个prohemocyte确定的血细胞。图1b显示了其椭球的形状和高细胞质核比（550X的放大倍率）为基础的oenocytoid分类血细胞。最后，图1C显示一个粒型血细胞（550X的放大倍率）。粒颗粒性质，而且往往在形状和行为更变形虫，因为他们坚持以玻璃表面。使用原先公布的血细胞打字和恢复11的标准，我们的收集方法取得了类似的总血细胞数量和我们同样发现，粒细胞构成的总血细胞的比例最大的11（图2）。
图1。一个有代表性的HEMA3固定，染色prohemocyte光显微镜图像（A）oenocytoid（B）和粒（三）从AE。埃及伊蚊成年女性。 C =细胞质，N =核摹=颗粒。
图2。总计数± SE的每雌蚊获得所有的血细胞和粒细胞，我们的血淋巴中的稀释和收集方法。
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Discussion
这里描述的血细胞的采集方法是从先前公布的方法修改，并允许一个孤立伊蚊血细胞的清洁准备用更少的步骤。虽然我们特别感兴趣的特征伊蚊血细胞种群的谎言，我们相信这种技术可以应用于其他蚊虫群体后进行的初步试验，以确定正确的注入量。本协议代替盐溶液中使用抗凝血剂的缓冲区，并产生血细胞的人口，准确地反映体内的数字。然而，我们还没有确定是否适合我们的协议，为维护文化的孤立的血细胞。
通过削减长鼻收集血淋巴已被证明产生循环的血细胞数量最少，不会再在这里讨论。灌注的方法，而易于进行，被批评为允许更大程度的污染，从内部组织和规模的11。最近，高喷射/恢复方法，以改善血细胞的恢复，同时减少污染 11的水平，但必须注入和收集步骤。我们的协议得到回收的血细胞和减少污染物的同一水平，但与更少的注入和收集的步骤，从而提供一个简单而准确的的方法来获得干净的血细胞的准备工作。首先，简单的步骤，在我们的协议消除腿，翅膀和腹部是收集血淋巴血细胞的更清洁的筹备工作的结果，单独在一个容器中的一角。其次，为我们的方法的收益利用在连接到了积极的位移微量一针持有人持有的玻璃针的准确性。虽然稀释剂同样可以使用手持针注入或其他手持式输送装置，使用一个微量的增加一致的音量收集血淋巴中的交货量和随后的结果的准确性。我们的试验表明，结合注射量9.5至10.5μL（步骤4.1和4.4），使我们能够坚持收集9-10μL注入雌蚊（未发表数据）的血淋巴，从而提供量化血细胞群体的一致性的另一项措施。我们的方法简化了删除其他手持注射针头和/或玻璃毛细管收集稀释血淋巴的需要，全面收集。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢约翰弗雷和皮特森本蚊虫饲养。我们也感谢恭戴维斯和加里Radice与血细胞显微镜的帮助。这项研究是由美国里士满大学艺术和科学的夏季奖学金AA Qayum和教师授予答：特朗。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
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