ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים
Summary
פרוטוקול זה הוא פשוט assay הידבקות חיידקים המורכב לספור את המספרים של המושבה חיידקי הקמת יחידות כי הם דבקו על תאים בתרבית. Assay היא חזקה, עצמאית של adhesin למד, וכן וריאציות רבות משמשים ברוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.
Abstract
כדי לגרום לזיהומים, חיידקים חייב ליישב המארח שלהם. חיידקים פתוגנים לבטא מולקולות שונות או מבנים מסוגל לקדם מצורף לארח תאים 1. Adhesins אלה מסתמכים על אינטראקציות עם התא המארח הקולטנים או חלבונים מסיסים מתנהג כמו גשר בין חיידקים המארח. הידבקות היא צעד ראשון קריטי לפני הפלישה ו / או הפרשת רעלים, ולכן הוא אירוע מפתח להיחקר בפתוגנזה חיידקי. יתר על כן, לעתים קרובות חיידקים דבק לגרום להפליא מכויל התגובות הסלולר, המחקרים אשר הולידו בתחום 2 "הסלולר מיקרוביולוגיה". מבחני עמידות עבור הידבקות חיידקים על תאים המארח הפלישה שלהם ולכן ממלאים תפקידים מרכזיים מחקרים בפתוגנזה חיידקים כבר מזמן משמשים רבים חלוץ במעבדות 3,4. מבחני אלה התאמן היום על ידי רוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.
כאן אנו מתארים assay דבקות תקן הממחישות את התרומה של adhesin ספציפיים. אנו משתמשים זן coli Escherichia 2787 5, זן פתוגניים האדם לבטא את autotransporter Adhesin מעורב דבקות מפוזר (AIDA). כמו שליטה, אנו משתמשים זן מוטנטי חסר את הגן אאידה, 2787Δ אאידה (פ Berthiaume ומ Mourez, לא פורסם), וכן מעבדה זן מסחרי של E. coli, C600 (ניו אינגלנד Biolabs). חיידקים נשארים לדבוק תאים מן השורה נפוץ HEP-2 תאים אנושיים אפיתל. Assay זו תוארה בהרחבה לפני פחות 6.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מתאר assay תקן היצמדות חיידקית כי ניתן לשנות ללמוד הפלישה (למשל באמצעות גנטמיצין assay הגנה 3). ספירת יחידות המושבה להרכיב מאפשרת כימות, על ידי השוואה עם גישות להסתמך על טכניקות להדמיה תקן תחת מיקרוסקופ, כגון מכתים Giemsa. זה האחרון רק נותן תצוגה איכותית של ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה במעבדות של המחברים נתמך על ידי תרומות של למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה, המכונים לחקר קנדה הבריאות, את תוכנית המחקר קנדה כיסאות. JL נתמך על ידי מענק של Groupe d'אטיוד דה Protéines Membranaires (GEPROM) באמצעות מימון מן דה Fonds משוכלל ונדיר en סנטה du קוויבק.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose DMEM | GIBCO-Invitrogen | 12430-054 |
| DDPBS | GIBCO-Invitrogen | 14190-144 |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO-Invitrogen | 15140-148 |
| 24 well plates | Corning | 3337 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
- Kline, K. A. Bacterial adhesins in host-microbe interactions. Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. Cellular microbiology emerging. Science. 271, 315-315 (1996).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Molecular Cellular Microbiology. , 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Molecular Cellular Microbiology. , 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E. Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae. FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
