ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured
Summary
מחקרים עדכניים רבים זיהו מוטציות חלבונים סינפטיים הקשורים פתולוגיות במוח. ראשי נוירונים בקליפת המוח בתרבית להציע גמישות רבה לבחון את ההשפעות של מחלות אלה הקשורים חלבונים על מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים.
Abstract
הקוצים הדנדריטים הם האתרים של רוב הקשרים מעוררים בתוך המוח, ויוצרים את תא פוסט סינפטי של סינפסות. מבנים אלו עשירים אקטין הוכח להיות מאוד דינמי. בתגובה פלסטיות Hebbian הקלאסית כמו גם אותות neuromodulatory, הקוצים הדנדריטים יכולים לשנות את הצורה ואת מספר, אשר נחשב קריטי עבור עידון של מעגלים עצביים ועל עיבוד ואחסון של מידע בתוך המוח. בתוך הקוצים הדנדריטים, רשת מורכבת של חלבונים הקישור אותות תאיים עם cyctoskeleton אקטין המאפשר שליטה על מורפולוגיה עמוד השדרה במספר הדנדריטים. מחקרים Neuropathological הוכיחו כי מספר מדינות המחלה, החל סכיזופרניה הפרעות הספקטרום האוטיסטי, להציג עמוד השדרה נורמלי מורפולוגיה הדנדריטים או מספרים. יתר על כן, מחקרים גנטיים האחרונות זיהו מוטציות בגנים המקודדים חלבונים רבים הסינפטי, המוביל הצעות כי חלבונים אלה עשויים לתרום גמישות עמוד השדרה סוטה כי, בין השאר, בבסיס הפתופיזיולוגיה של הפרעות אלה. על מנת ללמוד את התפקיד הפוטנציאלי של חלבונים אלה בשליטה מורפולוגיות עמוד השדרה הדנדריטים / מספר, השימוש של נוירונים בקליפת המוח בתרבית מציע מספר יתרונות. ראשית, מערכת זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של הקוצים הדנדריטים בתאים קבועים, כמו גם זמן לשגות הדמיה של תאים חיים. שנית, זו מערכת חוץ גופית מאפשר מניפולציה קלה של תפקוד החלבון על ידי ביטוי של חלבונים מוטנטים, מציאה על ידי בונה shRNA, או טיפולים תרופתיים. טכניקות אלו מאפשרים לחוקרים להתחיל לנתח את התפקיד של מחלות הקשורות חלבונים לחזות כיצד מוטציות של חלבונים אלה יפעלו in vivo.
Protocol
Discussion
הטכניקות המתוארות לעיל עבור ניתוח כמותי מפורט של עמוד השדרה הדנדריטים מורפולוגיה, תנועתיות צפיפות לינארית בשני הנוירונים קבוע או לחיות קליפת המוח העיקריים הם התמקדו בהבנת ההשפעות של הפוסט סינפטי מנגנונים עשויים לתרום neuropathologies. גישה דומה ניתן לכמת מורפולוגיה תנועת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים קלי ג'ונס לעריכה זהיר. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק R01MH 071,316, האגודה לאלצהיימר, הברית הלאומית למחקר על סכיזופרניה ודיכאון (NARSAD), והברית הלאומית לחקר האוטיזם (NAAR) (PP); American Heart Association אחוות דוקטורים (DPS); האמריקאי איגוד הלב אחוות Predoctoral (KMW).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 18 mm round Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm square Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P-0899 | MW 70~150 Kda |
| Neurobasal Media | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140148 | |
| D,L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | MediaTech Cellgro | 25-060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Formaldehyde Solution | EMD Chemicals | FX0415-5 | 36%, Histology grade |
| Normal Goats Serum | VWR | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Special Packaging |
| Enclosed imaging stage chamber | Warner | RC-30HV | |
| Temperature controller unit | Warner | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
References
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
- Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
- Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
- Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
- Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
- Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
